清華新聞網(wǎng)11月22日電 T-box核糖開(kāi)關(guān)是一類位于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌mRNA的5’非翻譯區(qū)的順式作用RNA元件。革蘭氏陽(yáng)性菌是一大類包括可引起結(jié)核病、壞疽、肉毒中毒、炭疽熱、心臟內(nèi)壁炎癥和其他疾病的病原體。T-box核糖開(kāi)關(guān)長(zhǎng)度通常在300核苷酸以下，可分為適配體結(jié)構(gòu)域和表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域。T-box核糖開(kāi)關(guān)通過(guò)其適配體結(jié)構(gòu)域識(shí)別和結(jié)合特定的tRNA并感知其3’末端的氨酰化狀態(tài)，引發(fā)下游RNA元件構(gòu)象狀態(tài)的轉(zhuǎn)變進(jìn)而在翻譯水平或轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控下游基因的表達(dá)，這些下游基因通常與氨基酸的代謝密切相關(guān)。與其他核糖開(kāi)關(guān)一般通過(guò)識(shí)別小分子代謝物或離子調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制不同，T-box核糖開(kāi)關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的功能主要是通過(guò)兩個(gè)高度結(jié)構(gòu)化的RNA（即T-box核糖開(kāi)關(guān)和tRNA）之間的相互作用實(shí)現(xiàn)的。近年來(lái)多種T-box核糖開(kāi)關(guān)與tRNA復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)已被解析，但是分子內(nèi)和分子間的RNA-RNA相互作用是如何促進(jìn)T-box核糖開(kāi)關(guān)折疊和發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變進(jìn)而形成特定構(gòu)象狀態(tài)以發(fā)揮生理功能的機(jī)制仍不清楚。
11月15日，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所方顯楊研究組與清華大學(xué)生命學(xué)院陳春來(lái)課題組合作，在《自然·通訊》（Nature communications）在線發(fā)表了題為“翻譯調(diào)控型T-box核糖開(kāi)關(guān)折疊與tRNA識(shí)別耦聯(lián)的結(jié)構(gòu)與動(dòng)態(tài)機(jī)制”（Structural and dynamic mechanisms forcoupled folding and tRNA recognition of atranslational T-box riboswitch）的研究論文。研究中，研究人員整合應(yīng)用小角X射線散射（SAXS）技術(shù)、單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移（smFRET）技術(shù)以及分子動(dòng)力學(xué)模擬，探究了來(lái)自皮疽諾卡氏菌（Nocardia farcinica）的特異性識(shí)別異亮氨酸的ileS T-box核糖開(kāi)關(guān)適配體結(jié)構(gòu)域（包含stem I, stem II和stemIIA/B莖環(huán)元件）在溶液中的折疊與構(gòu)象動(dòng)態(tài)，揭示了由鎂離子及ileS-tRNA結(jié)合調(diào)控的T-box核糖開(kāi)關(guān)適配體結(jié)構(gòu)域的折疊動(dòng)態(tài)過(guò)程和相應(yīng)的自由能面，為深入理解RNA-RNA相互作用對(duì)RNA折疊與識(shí)別的重要影響以及發(fā)展和理性設(shè)計(jì)靶向RNA的新型抗生素藥物提供了理論依據(jù)。
研究中，為實(shí)現(xiàn)對(duì)T-box核糖開(kāi)關(guān)適配體結(jié)構(gòu)域的多對(duì)位點(diǎn)熒光探針標(biāo)記（dense labeling）進(jìn)而利用smFRET技術(shù)全面研究其構(gòu)象動(dòng)態(tài)，方顯楊研究組設(shè)計(jì)并化學(xué)合成了堿基被炔基修飾的NaM非天然核苷酸NaM（NaMCO），結(jié)合研究組此前設(shè)計(jì)合成的堿基被氨基修飾的TPT3非天然核苷酸（TPT3A），發(fā)展了基于非天然堿基系統(tǒng)（NaM-TPT3）的長(zhǎng)鏈RNA位點(diǎn)特異性熒光探針正交標(biāo)記技術(shù)（圖1）。通過(guò)重疊延伸PCR以及體外轉(zhuǎn)錄，可向RNA的特定位點(diǎn)引入化學(xué)修飾的非天然堿基（NaMCO, rTPT3A），隨后通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)以及NHS酯基與氨基的化學(xué)反應(yīng)可將正交的熒光探針（如Cy3, Cy5）與非天然堿基相耦聯(lián)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)RNA的位點(diǎn)特異性熒光標(biāo)記。該方法突破了傳統(tǒng)RNA位點(diǎn)特異性標(biāo)記技術(shù)如化學(xué)合成等在RNA長(zhǎng)度、標(biāo)記位點(diǎn)、標(biāo)記效率及對(duì)結(jié)構(gòu)的干擾等方面的局限性，將極大推動(dòng)和拓展smFRET技術(shù)在研究長(zhǎng)鏈RNA構(gòu)象動(dòng)態(tài)以及解析其三維結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用。
圖1. 基于非天然堿基系統(tǒng)的RNA位點(diǎn)特異性熒光標(biāo)記技術(shù)
利用基于非天然堿基系統(tǒng)的位點(diǎn)特異性正交熒光標(biāo)記策略，研究人員在T-box核糖開(kāi)關(guān)適配體結(jié)構(gòu)域上選擇了七對(duì)標(biāo)記位點(diǎn)，構(gòu)建了一個(gè)密集的標(biāo)記網(wǎng)絡(luò)，得以全面的探究tRNA及鎂離子誘導(dǎo)的T-box核糖開(kāi)關(guān)適配體的構(gòu)象動(dòng)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，鎂離子可以穩(wěn)定stemIIA/B假結(jié)結(jié)構(gòu)，使其與stemII結(jié)構(gòu)域共軸堆積，進(jìn)而誘導(dǎo)stemI與stemII結(jié)構(gòu)域的預(yù)對(duì)接，使T-box折疊為可以結(jié)合tRNA的活性構(gòu)象，而tRNA的結(jié)合則進(jìn)一步誘導(dǎo)了stemI與stemII結(jié)構(gòu)域的對(duì)接。此外，研究者也利用SAXS技術(shù)結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬建立了T-box核糖開(kāi)關(guān)不同長(zhǎng)度的轉(zhuǎn)錄中間產(chǎn)物（T77, T89）在不同鎂離子條件下的溶液結(jié)構(gòu)模型，并結(jié)合突變實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了stemIIA/B假結(jié)結(jié)構(gòu)以及S-turn結(jié)構(gòu)基序在T-box識(shí)別tRNA過(guò)程中的重要作用。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究者們提出了鎂離子及tRNA介導(dǎo)的T-box核糖開(kāi)關(guān)適配體的共轉(zhuǎn)錄折疊模型（圖2），揭示了在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中T-box核糖開(kāi)關(guān)各個(gè)結(jié)構(gòu)元件相互協(xié)同調(diào)控促進(jìn)其折疊，最終保證其能高效、快速識(shí)別tRNA的分子機(jī)制。總的來(lái)說(shuō)，該工作揭示了鎂離子以及分子內(nèi)或分子間的RNA-RNA相互作用之間的微妙平衡在調(diào)控T-box核糖開(kāi)關(guān)折疊以及功能中的作用。
圖2. 鎂離子及tRNA介導(dǎo)的翻譯型T-box的折疊模型
中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所方顯楊研究員與清華大學(xué)生命學(xué)院陳春來(lái)副教授為該論文的共同通訊作者。清華大學(xué)生命學(xué)院博士后牛曉林為該論文的第一作者。清華大學(xué)生命學(xué)院2017級(jí)博士生徐鐘河，方顯楊研究組研究助理張宇帆為研究工作作出了重要貢獻(xiàn)；美國(guó)阿貢國(guó)家實(shí)驗(yàn)室左孝兵博士收集了SAXS數(shù)據(jù)。研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金委、中科院先導(dǎo)項(xiàng)目B、北京市生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心、中國(guó)博士后科學(xué)基金以及清華大學(xué)“水木學(xué)者”計(jì)劃的經(jīng)費(fèi)支持。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41467-023-43232-z
供稿：生命學(xué)院
題圖設(shè)計(jì)：韓羽臻
編輯：李華山
審核：郭玲
