清華新聞網(wǎng)2月2日電 2月1日，清華大學(xué)生命學(xué)院劉俊杰課題組在《科學(xué)》（Science）雜志在線發(fā)表了題為《可編程的水解型核酸內(nèi)切核酶用于DNA靶向切割》（Hydrolytic endonucleolytic ribozyme（HYER）is programmable for sequence-specific DNA cleavage）的研究論文，報道了一種催化性RNA（核酶）—HYER（水解型內(nèi)切核酶）。HYER可序列特異地切割RNA和DNA底物，并對哺乳動物細(xì)胞基因組產(chǎn)生位點特異的編輯。無需蛋白核酸酶的參與，HYER的底物識別和切割均由RNA分子實現(xiàn)，有望成為繼CRISPR之后新一代的基因編輯底盤工具。
圖1.歷代基因編輯工具
基因承載著遺傳信息，定義了生命的多樣性和復(fù)雜性。基因編輯是理解和改造生命的關(guān)鍵技術(shù)，在生物學(xué)研究和生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。歷代基因編輯工具如巨核酸酶、ZFNs、TALENs，均以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)識別和切割DNA，編輯位點的重編程較為困難。目前被廣泛使用的CRISPR-Cas工具，是RNA引導(dǎo)的蛋白核酸酶，通過引導(dǎo)RNA的間隔序列來識別DNA，具有很好的編輯位點重編程能力，但依然存在著PAM序列限制、分子量大、蛋白免疫原性等多種問題。
HYER源自細(xì)菌逆轉(zhuǎn)座子（第二類內(nèi)含子，GIIintron），一種可在宿主基因組上“拷貝和粘貼”（逆轉(zhuǎn)座）的可移動元件。該元件通常編碼一個兼具核酸酶和逆轉(zhuǎn)錄酶活性的蛋白質(zhì)以及一個RNA分子，通過形成蛋白核酸復(fù)合物(RNP)來執(zhí)行在宿主基因組中的逆轉(zhuǎn)座擴增。有趣的是，通過廣泛的生物信息學(xué)篩選，劉俊杰課題組發(fā)現(xiàn)了許多不編碼蛋白的、緊湊的二類C型內(nèi)含子（ORF-lessGII-Cintron）在細(xì)菌基因組中存在多拷貝的現(xiàn)象。這一現(xiàn)象暗示，這些內(nèi)含子編碼的唯一組份RNA分子，可能具有不依賴蛋白的擴增位點識別和切割能力，來實現(xiàn)內(nèi)含子在宿主基因組內(nèi)的拷貝擴增。
圖2.不含蛋白組分的第二類內(nèi)含子RNA在基因組中“拷貝和粘貼”的假設(shè)示意圖
生化實驗表明，這些長度約600nt的RNA分子在廣譜的離子濃度和溫度范圍內(nèi)，具有顯著的RNA和DNA水解切割活性。因此，研究人員將這些RNA分子命名為水解型內(nèi)切核酶（Hydrolytic Endonucleolytic Ribozymes, HYERs），這是科學(xué)界首次報道具有DNA水解切割能力的核酶（Ribozyme）。值得注意的是，HYER1和HYER2表現(xiàn)出了與緊湊型的CRISPR-Cas12e（CasX）和Cas12l（Casπ）相當(dāng)?shù)腄NA體外切割效率。為檢驗HYER在細(xì)胞內(nèi)的DNA切割能力，研究人員在大腸桿菌中構(gòu)建了ccdB毒蛋白報告系統(tǒng)，證明HYER1和HYER2可以對帶有ccdB毒基因的質(zhì)粒進(jìn)行靶向切割。在HEK293T細(xì)胞內(nèi)，研究人員構(gòu)建了移碼Puromycin抗性基因（puro*）報告系統(tǒng)。結(jié)果表明，HYER1可對puro*產(chǎn)生移碼編輯，賦予細(xì)胞Puromycin抗性。在抗性篩選富集后的細(xì)胞里，三個靶位點中最高的編輯效率為9.18%。這表明，HYER可以在真核細(xì)胞基因組中引入雙鏈斷裂并產(chǎn)生編輯。然而，在未經(jīng)Puromycin篩選富集的細(xì)胞中，編輯效率僅為0.09%到0.2%，表明HYER的真核基因編輯能力還有很大的進(jìn)步和優(yōu)化空間。
研究人員利用冷凍電鏡獲得了HYER1的高分辨三維結(jié)構(gòu)（3.0?），發(fā)現(xiàn)HYER1以同源二聚體的形式存在，并揭示HYER1水解切割DNA的機理。HYER1通過一段暴露的單鏈RNA（6nt）區(qū)域，TRS（Target Recognition Site），識別并招募DNA底物，將DNA捕獲在結(jié)構(gòu)域V所形成的催化核心中，通過經(jīng)典的雙鎂離子機制催化DNA水解。
圖3.HYER1的電子密度圖和DNA水解切割機制
基于HYER的三維結(jié)構(gòu)，研究人員進(jìn)行了多種理性設(shè)計，證明HYER具有良好的可編程性，可根據(jù)底物序列靈活設(shè)計TRS的序列和長度；在TRS臨近區(qū)域插入14nt的底物招募序列（Recruiting Sequence,RS），可明顯提高HYER1的底物識別特異性和切割效率；對回文序列和TRS進(jìn)行改造， HYER1則可形成帶有兩個不同TRS的異源二聚體，靶向雙鏈DNA底物的不同區(qū)域，產(chǎn)生了具有5’突出、3’突出或平末端的定制化切割產(chǎn)物。
受“RNA世界”假說的啟發(fā)，研究人員提出了第二類內(nèi)含子中的“RNA的催化功能逐漸被蛋白質(zhì)取代”的分子進(jìn)化歷程：在進(jìn)化過程中，第二類內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)域IV逐漸擴大，并產(chǎn)生了可編碼短肽的開放閱讀框（ORF），而這些短肽可作為順式元件與內(nèi)含子RNA相互作用，增強其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和催化活性；隨著ORF變得更長、更為成熟，其編碼的蛋白質(zhì)不僅起到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用，亦獲得了DNA切割和逆轉(zhuǎn)錄活性，以替代RNA核酶行使催化功能。該成果不僅拓展了科學(xué)界對“RNA世界”假說和RNA催化功能的理解，也為創(chuàng)制具有我國完全自主知識產(chǎn)權(quán)的新型核酸操縱底盤工具，以及將其進(jìn)一步用于基因編輯和RNA編輯等奠定了基礎(chǔ)。
圖4.第二類內(nèi)含子的進(jìn)化假想
清華大學(xué)生命學(xué)院劉俊杰副教授為本文通訊作者；清華大學(xué)生命學(xué)院2021級博士生劉子賢、高精尖結(jié)構(gòu)中心卓越學(xué)者張壽悅博士、2020級博士生朱漢舟、博士后陳之航、2019級博士生楊韻和2022級博士生李隆騏為該文共同第一作者；清華大學(xué)生命學(xué)院2021級本科生劉云、2018級博士生李丹苑、2020級博士生孫奧、李承平、2021級博士生譚順青、2023級博士生王高立、2023級博士生沈婕怡、水木學(xué)者靳帥博士，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究員和2020級博士生雷源為本研究作出了大力貢獻(xiàn)。清華大學(xué)冷凍電鏡平臺為本研究提供了設(shè)備和技術(shù)支持。本研究得到了基金委原創(chuàng)項目（32150018）、農(nóng)業(yè)部和清華大學(xué)的經(jīng)費、資源支持。
論文鏈接：
Hydrolytic endonucleolytic ribozyme (HYER) is programmable for sequence-specific DNA cleavage | Science
供稿：生命學(xué)院
編輯：黃思南
審核：王曉霞
