清華新聞網(wǎng)5月9日電 PROTAC（PROteolysis TArgeting Chimera，靶向蛋白降解嵌合體）技術(shù)是近年來新興的前沿化學生物技術(shù)。其原理是通過一個異雙功能小分子同時拉近目標蛋白和E3泛素連接酶之間的距離，進而誘導目標蛋白的多聚泛素化以及通過泛素-蛋白酶體途徑的降解。截至目前，該技術(shù)已經(jīng)成功實現(xiàn)了上百種靶蛋白的降解。
天然產(chǎn)物作為藥物發(fā)現(xiàn)的重要來源，擁有多樣的化學結(jié)構(gòu)及廣泛的生物學活性。通過表型篩選，科學家們能夠深入地了解受天然產(chǎn)物影響的細胞表型、信號通路和疾病表型，但天然產(chǎn)物精準的靶點鑒定仍然是該領域面臨的主要挑戰(zhàn)。由于天然產(chǎn)物通常具有多靶點特性，并且與靶蛋白的結(jié)合力中等或偏弱，現(xiàn)有的靶點鑒定策略在鑒定天然產(chǎn)物的特定靶點時面臨著一定的挑戰(zhàn)。
目前最為主流的靶點鑒定策略是基于活性的蛋白質(zhì)分析（Activity-Based Protein Profiling，ABPP）。該策略的原理是先通過小分子與靶蛋白之間形成共價鍵，隨后通過linker引入報告基團如熒光基團或biotin，再通過凝膠熒光成像或biotin富集后的定量蛋白質(zhì)組學來進行靶點鑒定。對于非共價小分子，ABPP需要外源引入光交聯(lián)基團來實現(xiàn)共價交聯(lián)。盡管該技術(shù)目前已被廣泛應用于小分子藥物的靶點鑒定，但它仍存在一些局限性。其高度依賴于小分子與靶蛋白之間的結(jié)合力，因此需要形成穩(wěn)定的共價相互作用，而光交聯(lián)基團的引入條件較為苛刻，且會產(chǎn)生大量的非特異性結(jié)合并對組學結(jié)果的分析造成一定的干擾。目前尚缺少一種基于非共價結(jié)合的靶點鑒定策略，而PROTAC技術(shù)的出現(xiàn)有望填補該空白。PROTAC的本質(zhì)是小分子誘導的蛋白質(zhì)互作，其不完全依賴于小分子與靶蛋白之間的結(jié)合力，理論上，弱結(jié)合靶蛋白通過PROTAC技術(shù)也能夠?qū)崿F(xiàn)高效的降解。
近期，清華大學藥學院饒燏課題組結(jié)合了PROTAC技術(shù)與蛋白質(zhì)組學技術(shù)，系統(tǒng)性地提出了全新的靶點鑒定策略——基于降解的蛋白質(zhì)分析（Degradation-Based Protein Profiling，DBPP），并將其應用于中藥活性成分雷公藤紅素的靶點鑒定（圖1）。通過使用一整套PROTAC工具箱，研究人員成功鑒定了雷公藤紅素的三個已知靶點PI3Kα、IKKβ、CIP2A以及三個潛在新靶點CHK1、OGA、ERCC6L，證明了該策略的強大能力。DBPP策略是PROTAC技術(shù)在靶點鑒定領域的新應用，為解決領域內(nèi)關(guān)鍵問題提供了新方法。
圖1.ABPP與DBPP對比模式圖
首先，研究人員基于雷公藤紅素的構(gòu)效關(guān)系研究構(gòu)建了相應的PROAC化合物庫（圖2）。綜合考慮細胞表型、linker的長度及類型等多個因素，他們挑選出由四個PROTAC分子組成的靶點鑒定工具箱。
圖2.PROTAC化合物庫的構(gòu)建及工具箱的選擇
隨后，他們分別對工具箱中的PROTAC分子進行了TMT標記的定量蛋白質(zhì)組學實驗（圖3）。綜合組學分析結(jié)果與雷公藤紅素的生物學功能，他們初步挑選了包括PI3Kα、IKKβ、CHK1、OGA、NEK7、DCAF16在內(nèi)的六個潛在靶點。通過對上述靶點的初步驗證，他們進一步聚焦于PI3Kα、IKKβ、CHK1和OGA的研究。在此過程中，他們發(fā)現(xiàn)不同的分子對不同的靶蛋白表現(xiàn)出了一定程度的降解選擇性，該結(jié)果與實驗設計的初衷相符合。
接著，他們對上述靶點開展了進一步的驗證工作。他們先通過兩個已知靶點PI3Kα、IKKβ建立了一套適用于DBPP的評估體系，其中包括靶蛋白降解普適性的驗證、降解機制的驗證、三元復合物形成的驗證以及雷公藤紅素與靶蛋白之間直接相互作用的驗證，并將該體系成功應用于新靶點CHK1和OGA的研究。
最后，他們對DBPP策略進行了兩個方面的優(yōu)化。通過綜合分析降解組學和IP組學以及引入混合分子蛋白質(zhì)組學的方式，他們進一步提高了該策略的效率及準確性。
圖3. 靶點驗證及策略優(yōu)化
綜上，研究人員將PROTAC技術(shù)與多種蛋白質(zhì)組學技術(shù)相結(jié)合，提出并進一步優(yōu)化了DBPP非共價靶點鑒定新策略，該策略不僅適用于天然產(chǎn)物的靶點鑒定，還可用于現(xiàn)有藥物分子的脫靶研究以及老藥新用。通過與現(xiàn)有的靶點鑒定策略相互補充，DBPP策略有望推動藥學相關(guān)領域的發(fā)展。
4月25日，相關(guān)研究成果以“基于降解的蛋白質(zhì)分析策略：以雷公藤紅素的靶點研究為例”（Degradation-Based Protein Profiling: A Case Study of Celastrol）為題，發(fā)表于《先進科學》（Advanced Science）。
清華大學藥學院饒燏課題組2018級博士生倪智豪、2020級博士生施奕（CLS項目）為論文共同第一作者，清華大學藥學院教授饒燏為論文通訊作者，清華大學藥學院2020級博士生劉乾隆、已畢業(yè)博士王立國以及昌平實驗室研究員孫秀云參與了該工作。研究得到首都醫(yī)科大學教授高偉和清華大學教授鄧海騰的幫助，并得到清華大學蛋白質(zhì)化學與組學平臺的技術(shù)支持。研究還得到中國國家自然科學基金和國家重點研發(fā)計劃的大力支持。
論文鏈接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202308186
供稿：藥學院
編輯：李華山
審核：郭玲
