清華新聞網(wǎng)5月31日電 CRISPR系統(tǒng)是一種存在于原核生物中的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，用于抵御外來DNA的入侵。在長期的免疫防御斗爭中，CRISPR系統(tǒng)已經(jīng)演化成多種類型，其中，Cas9通過引導(dǎo)RNA（gRNA）切割外源DNA的特性被廣泛研究和應(yīng)用到基因編輯領(lǐng)域。Cas9系統(tǒng)具有多種亞型，如II-A、II-B和II-C，其中II-C型的Cas9的多樣性最高。然而CRISPR-Cas9系統(tǒng)是否存在額外的機(jī)制以對抗病毒的免疫逃逸競爭尚且未知，通過挖掘并解析這些未知的機(jī)制，有助于進(jìn)一步拓展我們對于CRISPR系統(tǒng)進(jìn)化過程的了解并且進(jìn)一步提升其基因編輯效率。
5月29日，清華大學(xué)生命學(xué)院劉俊杰（Jun-Jie Gogo Liu）課題組聯(lián)合北京大學(xué)生命學(xué)院白洋課題組和清華大學(xué)生命學(xué)院陳春來課題組在《自然》（Nature）雜志在線發(fā)表了題為“CRISPR免疫增效子PcrIIC1增強(qiáng)細(xì)菌Cas9系統(tǒng)免疫能力”（Pro-CRISPR PcrIIC1-associated Cas9 system for enhanced bacterial immunity）的研究論文。
通過生物信息學(xué)分析，研究團(tuán)隊(duì)觀察到一類新型關(guān)聯(lián)基因（Novel-associated genes, NAGs），顯著富集存在于較大蛋白體積的II-C型Cas9的基因簇中，并推測這些NAGs可能參與到Cas9介導(dǎo)的細(xì)菌免疫過程中。為了進(jìn)一步探索Cas9和NAGs的關(guān)系，研究人員開發(fā)了一套結(jié)構(gòu)生長軌跡分析方法（structural growth trajectory analysis, SGT analysis），通過預(yù)測1381個(gè)II-C型Cas9的蛋白結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了對Cas9蛋白結(jié)構(gòu)演變的量化和軌跡分析。通過分析，發(fā)現(xiàn)了較大蛋白體積的II-C型Cas9存在自身新功能結(jié)構(gòu)域生長進(jìn)化的趨勢，呈現(xiàn)出三條不同的蛋白體積逐漸變大的進(jìn)化軌跡。研究人員還發(fā)現(xiàn)與NAGs的協(xié)同作用富集在三條生長軌跡的終點(diǎn)，這可能說明在漫長的進(jìn)化過程中，Cas9系統(tǒng)新功能結(jié)構(gòu)域的插入和NAGs的出現(xiàn)具有一定的相關(guān)性。
圖1.結(jié)構(gòu)生長軌跡分析方法（左）和II-C型Cas9的生長軌跡圖（右）
研究團(tuán)隊(duì)通過生化實(shí)驗(yàn)和冷凍電鏡解析復(fù)合體結(jié)構(gòu)表明，來自金黃色細(xì)菌屬（Chryseobacteriumsp.）的CbCas9生長出了一個(gè)全新的增強(qiáng)Cas9活性的β-REC2結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)全新的能夠與其關(guān)聯(lián)基因PcrIIC1互作的CTH結(jié)構(gòu)域。通過蛋白間相互作用，2個(gè)CbCas9蛋白和2個(gè)PcrIIC1蛋白能夠形成異源四聚體復(fù)合物。
圖2.CbCas9基因簇構(gòu)成（上）、CbCas9效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)（左下）和CbCas9-PcrIIC1復(fù)合體結(jié)構(gòu)（右下）
研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，PcrIIC1蛋白能夠作為一種CRISPR免疫增效子（Pro-CRISPR），通過與CbCas9形成異源四聚體復(fù)合體增強(qiáng)其活性。CbCas9-PcrIIC1復(fù)合物表現(xiàn)出增強(qiáng)的DNA結(jié)合和切割活性，更廣泛的前間隔序列鄰近基序（PAM）兼容性，更強(qiáng)的DNA雙鏈解旋能力以及對靶向序列互補(bǔ)錯配（mismatch）的容忍能力。
圖3.PcrIIC1增強(qiáng)CbCas9的DNA結(jié)合（a）、切割（b）、PAM兼容性（c）、DNA解旋（d）和錯配容忍（e）能力
為了進(jìn)一步探究PcrIIC1增強(qiáng)Cas9活性的具體機(jī)制，研究人員進(jìn)一步通過結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)，CbCas9-PcrIIC1復(fù)合物的能力增強(qiáng)來源于復(fù)合物中的兩個(gè)CbCas9能夠結(jié)合同一條長鏈DNA，通過更強(qiáng)的電荷相互作用，使得該復(fù)合物的DNA結(jié)合能力增強(qiáng)。并且，復(fù)合體中的兩個(gè)CbCas9通過協(xié)同作用，使得長鏈DNA發(fā)生扭曲和變構(gòu)，更容易被解旋，從而促進(jìn)了CbCas9-PcrIIC1復(fù)合物的DNA干擾（interference）能力。同時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)CbCas9能夠?qū)ΨQ地分別靶向長鏈DNA的兩條單鏈上的靶標(biāo)序列，從而提高其在基因組上搜尋靶標(biāo)的效率。
最終，為了檢驗(yàn)CRISPR免疫增效子PcrIIC1對CbCas9抗噬菌體免疫能力的影響，研究人員在大腸桿菌中進(jìn)行了抗噬菌體實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PcrIIC1顯著提升CbCas9系統(tǒng)對噬菌體的抵抗，且如果破壞CbCas9與PcrIIC1的相互作用，會導(dǎo)致增強(qiáng)的免疫力喪失。以上結(jié)果說明CbCas9-PcrIIC1復(fù)合體的形成對整個(gè)CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫增強(qiáng)至關(guān)重要。
圖4.PcrIIC1顯著增強(qiáng)了CbCas9系統(tǒng)的細(xì)菌免疫活性
研究開發(fā)了一套基于結(jié)構(gòu)的SGT進(jìn)化軌跡分析，鑒定出II-C亞型Cas9的進(jìn)化趨勢，首次發(fā)現(xiàn)了一類新型的CRISPR免疫增效子可以通過二聚化Cas9效應(yīng)器提升Cas9活性，這些結(jié)果不僅有助于我們進(jìn)一步理解CRISPR系統(tǒng)的進(jìn)化歷程，還為未來基于CRISPR免疫增效子的高效基因編輯工具的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
清華大學(xué)生命學(xué)院劉俊杰副教授、北京大學(xué)生命學(xué)院白洋研究員和清華大學(xué)生命學(xué)院陳春來副教授為論文通訊作者；清華大學(xué)生命學(xué)院博士后張壽悅、2020級博士生孫奧、中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所2017級直博生錢景美和清華大學(xué)生命學(xué)院2023級博士生林鑠為論文共同第一作者。中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞課題組、北京生命科學(xué)研究所董夢秋課題組對研究給予了大力支持。研究得到國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、自然科學(xué)基金委、農(nóng)業(yè)部、科學(xué)探索獎和清華大學(xué)與北京大學(xué)的經(jīng)費(fèi)、資源支持。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41586-024-07486-x
供稿：生命學(xué)院
編輯：李華山
審核：郭玲
