清華新聞網(wǎng)8月14日電 CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古生菌中對抗外源核酸入侵的獲得性免疫系統(tǒng)。基于CRISPR-Cas系統(tǒng)在RNA引導(dǎo)下靶向DNA的功能，科研人員已經(jīng)開發(fā)了多種被廣泛使用的基因編輯和調(diào)控工具。CasX（又稱Cas12e）屬于第2類CRISPR-Cas系統(tǒng)，因其體積較小，相較于廣泛使用的Cas9和Cas12a蛋白更便于遞送到細(xì)胞內(nèi)，展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。但除了共有的RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域外，CasX與Cas12a和Cas9在蛋白序列上相似性甚微。此外，CasX獨有的NTSB結(jié)構(gòu)域，對于其切割活性至關(guān)重要。這些不同之處暗示了CasX可能具有獨特的靶向和切割機制。
近日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳春來課題組與劉俊杰課題組合作在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）雜志發(fā)表了題目為“單分子FRET揭示CasX（Cas12e）在DNA切割過程中的構(gòu)象動態(tài)”（Conformational dynamics ofCasX(Cas12e) in mediating DNA cleavage revealed by single-molecule FRET）的研究論文。該論文細(xì)致表征了CasX從非特異性結(jié)合到找到靶點并完成切割的動態(tài)過程，揭示了其獨特的機制。
利用供體（Cy3）標(biāo)記的sgRNA和受體（Cy5）標(biāo)記的DNA，研究人員通過單分子FRET實驗捕捉到CasX蛋白在切割過程中依次呈現(xiàn)的三種構(gòu)象狀態(tài)：R-loop起始狀態(tài)、R-loop形成后非靶標(biāo)鏈（NTS）切割狀態(tài)和靶標(biāo)鏈（TS）切割狀態(tài)（圖1）。此外，研究人員還定量分析了sgRNA與DNA的匹配度如何影響CasX在DNA上的穩(wěn)定性和切割活性，為基于CasX的基因編輯和調(diào)控工具的設(shè)計提供了重要依據(jù)。DpbCasX和PlmCasX在切割特異性上的差異，源于它們在結(jié)合DNA及切割過程中的動力學(xué)差異；而兩者在切割過程中FRET模式的不同，則歸因于它們在DNA上切割位點的差異。
圖1.DpbCasX結(jié)合及切割全匹配DNA的構(gòu)象動態(tài)
本文中，研究人員還提出了“有效靶標(biāo)搜索效率”這一新的概念，用以衡量Cas蛋白在接觸靶標(biāo)后的有效識別效率。數(shù)據(jù)顯示，CasX的有效靶標(biāo)搜索效率（僅10%）遠(yuǎn)低于Cas9和Cas12a（50%-80%）。這意味著，CasX需要嘗試約10次才能成功識別靶標(biāo)位點，細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜環(huán)境可能進(jìn)一步降低其搜索效率，從而導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)較低的編輯活性。這一發(fā)現(xiàn)為未來優(yōu)化CasX以及其他Cas蛋白提供了新視角。
最后，研究人員構(gòu)建了CasX識別與切割DNA的動態(tài)模型（圖2）。CasX在搜尋靶點時與DNA短暫非特異性結(jié)合（Nonspecific binding），在動態(tài)搜索過程中識別PAM序列（PAM recognition），開始形成R-loop結(jié)構(gòu)（R-loop initiation），然而，相較于SpCas9、AsCas12a和LbCas12a，CasX在這一步的效率低5至8倍。識別PAM后，CasX依賴充足的PAM近端匹配驅(qū)動R-loop形成，并利用單一的RuvC結(jié)構(gòu)域活性中心依次切割NTS和TS（R-loop formation and NTS cleavage，TS cleavage），最后釋放切割產(chǎn)物（DNA fragment release）。CasX獨特的NTSB結(jié)構(gòu)域在DNA解旋和R-loop形成中發(fā)揮了重要功能。這一動態(tài)模型深化了我們對CasX工作機制的理解，并為CasX以及其他Cas蛋白的優(yōu)化和改造提出了新的思路和策略。
圖2.CasX結(jié)合和切割DNA的動態(tài)模型
清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院副教授陳春來和劉俊杰為論文共同通訊作者，生命科學(xué)學(xué)院2018級博士畢業(yè)生邢文婧和李丹苑為論文共同第一作者。生命科學(xué)學(xué)院高級工程師王文娟博士參與了研究。研究得到國家自然科學(xué)基金委、國家重點研發(fā)計劃、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、北京結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心、北京市生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心的經(jīng)費支持。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1093/nar/gkae604
供稿：生命學(xué)院
編輯：李華山
審核：郭玲
