清華新聞網(wǎng)8月20日電 寨卡病毒（ZIKV）是單股正鏈RNA病毒，與登革病毒（DENV）、西尼羅病毒（WNV）和黃熱病毒（YFV）等均屬于黃病毒科黃病毒屬。寨卡病毒對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，尤其對孕婦和胎兒更具危險(xiǎn)性。感染孕婦后，病毒可穿過血胎屏障，感染胎兒神經(jīng)前體細(xì)胞（Neural Progenitor Cells），引發(fā)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致新生兒小頭畸形。寨卡病毒利用多種機(jī)制逃避宿主的免疫系統(tǒng)，從而成功感染宿主并繁殖。泛素化是一種在細(xì)胞中普遍存在的蛋白翻譯后修飾方式，廣泛參與機(jī)體對病毒感染后的免疫應(yīng)答和信號傳導(dǎo)過程。寨卡病毒NS5蛋白具有RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）和RNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MTase）兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)病毒基因組RNA的復(fù)制和甲基化修飾。除了對病毒生命周期至關(guān)重要的酶活性外，NS5也在拮抗宿主免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。例如，西奈山伊坎醫(yī)學(xué)院（Icahn School of Medicine at Mount Sinai）的阿道夫·加西亞-薩斯特雷（Adolfo Garcia-Sastre）教授課題組在2016年報(bào)道，寨卡病毒NS5蛋白通過蛋白酶體途徑促進(jìn)STAT2的降解，但具體的E3泛素連接酶尚不明確。因此，鑒定直接參與降解STAT2的E3泛素連接酶并揭示其分子機(jī)制，對于理解寨卡病毒逃逸宿主免疫系統(tǒng)的策略，以及開發(fā)相關(guān)疾病的預(yù)防和治療方法具有重要意義。
為了解決這一科學(xué)問題，研究團(tuán)隊(duì)利用HEK293T細(xì)胞，構(gòu)建了ZIKV NS5介導(dǎo)STAT2降解的可視化報(bào)告細(xì)胞系。該細(xì)胞系可組成型表達(dá)STAT2-mCherry紅色熒光融合蛋白，而ZIKV NS5的表達(dá)則受四環(huán)素誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)Tet-On的調(diào)控。通過添加四環(huán)素類藥物誘導(dǎo)NS5的表達(dá)后，可以利用流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微鏡觀察到STAT2-mCherry的有效降解。利用該報(bào)告細(xì)胞系，結(jié)合CRISPR/Cas9全基因組篩選系統(tǒng)，作者篩選出一系列影響NS5介導(dǎo)STAT2降解的宿主基因（圖1）。其中，ZSWIM8基因引起作者的重點(diǎn)關(guān)注，該基因是Cullin-RING泛素連接酶（CRL）復(fù)合體的底物識別蛋白，該復(fù)合體參與降解microRNA代謝途徑的多個(gè)關(guān)鍵蛋白。
8月15日，清華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院丁強(qiáng)課題組在《美國國家科學(xué)院院刊》（PNAS）發(fā)表題為“寨卡病毒NS5蛋白利用宿主CRL3泛素連接酶降解STAT2從而抑制干擾素反應(yīng)”（Zika Virus NS5 Protein Inhibits Type I Interferon Signaling via CRL3 E3 ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of STAT2）的研究論文。該研究揭示寨卡病毒NS5蛋白通過招募CRL3泛素連接酶及其底物識別蛋白ZSWIM8，降解干擾素信號通路中的關(guān)鍵蛋白STAT2，從而抑制宿主抗病毒天然免疫的分子機(jī)制，并闡明該逃逸機(jī)制在病毒感染中的重要作用。
圖1. CRISPR/Cas9全基因組敲除文庫篩選流程圖
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲除ZSWIM8可有效抑制ZIKS NS5介導(dǎo)的STAT2降解，而過表達(dá)ZSWIM8則可促進(jìn)其對STAT2的降解。通過對Cullin-RING E3泛素連接酶（CRL）家族基因逐一敲除，研究團(tuán)隊(duì)鑒定出CRL3是負(fù)責(zé)STAT2降解的功能性E3泛素連接酶。NEDD8類泛素化修飾對于CRL3的泛素連接酶活性至關(guān)重要，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明NEDD8激活酶抑制劑MLN4924可以抑制NS5介導(dǎo)的STAT2的降解。隨后，通過一系列生化實(shí)驗(yàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)病毒NS5蛋白作為一個(gè)銜接蛋白，使得CRL3-ZSWIM8與STAT2發(fā)生相互作用，并對STAT2進(jìn)行泛素化修飾，進(jìn)而促進(jìn)其蛋白酶體降解。在A549細(xì)胞系和神經(jīng)前體細(xì)胞中，研究團(tuán)隊(duì)探討了病毒挾持CRL3-ZSWIM8復(fù)合物降解STAT2對病毒感染的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在以上兩種細(xì)胞中，敲除ZSWIM8后，ZIKV感染無法誘導(dǎo)STAT2降解，干擾素誘導(dǎo)基因（ISG）顯著上調(diào)，病毒感染明顯受到抑制；而同時(shí)敲除ZSWIM8和STAT2則可完全恢復(fù)病毒的感染能力，說明敲除ZSWIM8后病毒感染受到的抑制是因?yàn)椴荒苡行Ы到釹TAT2所導(dǎo)致。以上結(jié)果表明，ZIKV感染細(xì)胞后可引發(fā)宿主產(chǎn)生干擾素，然而病毒NS5蛋白可挾持CRL3-ZSWIM8 E3泛素連接酶實(shí)現(xiàn)對STAT2的降解，從而逃逸干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，實(shí)現(xiàn)高效感染（圖2）。
圖2.ZIKV NS5利用CRL3-ZSWIM8 E3連接酶復(fù)合物抑制干擾素信號通路
綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)寨卡病毒利用CRL3-ZSWIM8復(fù)合體降解宿主干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)關(guān)鍵蛋白STAT2，揭示寨卡病毒拮抗宿主抗病毒天然免疫的分子機(jī)制。利用化學(xué)抑制劑和遺傳敲除技術(shù)證明該逃逸機(jī)制在病毒建立感染以及致病過程中發(fā)揮重要作用。該研究不僅促進(jìn)了對寨卡病毒生命周期和致病機(jī)制的認(rèn)識，也為相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供了新靶點(diǎn)和新思路。
清華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院副教授丁強(qiáng)為論文通訊作者，清華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院任文琳博士為論文第一作者，課題組張羽、鞠曉輝、宋晶偉、龔明麗、李卓陽也參與了該課題的研究。清華大學(xué)生命學(xué)院教授姚駿以及課題組付崇雷、姜熙為研究作出了重要貢獻(xiàn)。浙江大學(xué)教授番文春和武漢大學(xué)教授雷曹琦為研究提供了寶貴意見。研究得到國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金、北京市自然科學(xué)基金、清華大學(xué)篤實(shí)基金、清華大學(xué)萬科公共衛(wèi)生與健康學(xué)科發(fā)展專項(xiàng)基金和山西醫(yī)科大學(xué)-清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院前沿醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心等的資助。
論文鏈接：
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2403235121
供稿：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院
題圖設(shè)計(jì)：韓羽臻
編輯：李華山
審核：郭玲
