清華新聞網(wǎng)9月12日電 微管（Microtubule）的動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性對(duì)其正常生理功能至關(guān)重要，這一過程依賴于多種微管蛋白（Tubulin）亞型在微管末端的組裝與去組裝。微管蛋白突變與多種人類疾病密切相關(guān)，因此，在活細(xì)胞中對(duì)微管蛋白進(jìn)行可視化標(biāo)記是研究其功能的關(guān)鍵策略，對(duì)于理解微管的動(dòng)態(tài)調(diào)控以及解相關(guān)疾病的病理機(jī)制具有重要意義。然而，現(xiàn)有方法在活細(xì)胞內(nèi)對(duì)微管蛋白低損傷、特異性和高效率標(biāo)記方面存在顯著局限（如綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記對(duì)微管蛋白的功能和定位產(chǎn)生較大影響，而免疫熒光染色無法對(duì)微管的動(dòng)態(tài)行為進(jìn)行研究），限制了對(duì)微管蛋白精確功能的理解以及相關(guān)疾病機(jī)制的闡釋。
近日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心歐光朔課題組在《公共科學(xué)圖書館·生物學(xué)》（PLOS Biology）雜志在線發(fā)表了題為“利用AlphaFold2優(yōu)化split-GFP技術(shù)對(duì)內(nèi)源微管蛋白進(jìn)行功能型熒光標(biāo)記”（AlphaFold2-guided engineering of split-GFP technology enables labeling of endogenous tubulins across species while preserving function）的方法學(xué)論文。該研究利用人工智能（Artificial Intelligence, AI）軟件AlphaFold2的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)能力，發(fā)展了能夠在活細(xì)胞內(nèi)對(duì)微管蛋白進(jìn)行低損傷、高效率熒光標(biāo)記的新技術(shù)。
研究人員利用AlphaFold2在split-GFP熒光互補(bǔ)標(biāo)記技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了鍵改進(jìn)。首先將16個(gè)氨基酸的GFP11短標(biāo)簽精準(zhǔn)插入至α-或β-微管蛋白的非保守H1-S2 loop區(qū)，然后利用AlphaFold2進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，優(yōu)化了GFP11兩端的連接子序列，確保GFP11與GFP1-10互補(bǔ)片段之間的穩(wěn)定互作，從而產(chǎn)生更強(qiáng)的熒光信號(hào)（圖1A）。通過AI技術(shù)的輔助，以及結(jié)構(gòu)匹配和分子模擬結(jié)果表明，該策略（GFP11-i）成功將split-GFP蛋白標(biāo)記在微管的中空管腔內(nèi)側(cè)，既不影響微管蛋白的折疊成熟過程，也不破壞微管的整體結(jié)構(gòu)與基本功能（圖1B-C）。
圖1.利用AlphaFold2對(duì)split-GFP標(biāo)記微管蛋白的策略進(jìn)行優(yōu)化
進(jìn)一步，研究人員在秀麗隱桿線蟲中采用基因敲入（knock-in）策略，對(duì)內(nèi)源的α-或β-微管蛋白進(jìn)行了GFP11-i標(biāo)記。結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)的GFP標(biāo)記方法相比，GFP11-i標(biāo)記對(duì)體內(nèi)如胚胎分裂、纖毛發(fā)生等與微管相關(guān)的重要生物過程的干擾更小，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了對(duì)內(nèi)源微管蛋白亞型的組織特異性標(biāo)記，并且能夠?qū)ν蛔兾⒐艿鞍走M(jìn)行高保真（低損傷）的活體標(biāo)記與動(dòng)態(tài)示蹤。通過在人源HeLa細(xì)胞系中轉(zhuǎn)基因表達(dá)GFP11-i標(biāo)記的人源微管蛋白TUBA1A（圖2A），以及在小鼠卵細(xì)胞中表達(dá)GFP11-i標(biāo)記的TUBA4A（圖2B），研究展現(xiàn)了GFP11-i在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中對(duì)微管蛋白的高標(biāo)記效率。
圖2. GFP11-i在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中高效率標(biāo)記微管蛋白
最后，為了探究GFP11-i能否高效標(biāo)記帶有人類疾病突變的微管蛋白突變體，研究人員將已知與人類不育相關(guān)的α-微管蛋白TUBA4A（E284G）突變體表達(dá)在HeLa細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)該疾病突變體嚴(yán)重破壞了微管網(wǎng)絡(luò)的形態(tài)（圖3A-C）。進(jìn)而，研究人員分別表達(dá)了傳統(tǒng)GFP標(biāo)記或GFP11-i標(biāo)記的TUBA4A（E284G），發(fā)現(xiàn)GFP標(biāo)記嚴(yán)重干擾其病理學(xué)表型，而GFP11-i則能夠高保真地對(duì)突變體微管蛋白進(jìn)行活細(xì)胞熒光標(biāo)記（圖3A-C），提示其在微管蛋白相關(guān)疾病研究中的重要應(yīng)用潛力與價(jià)值。
圖3.GFP11-i能夠高保真標(biāo)記疾病突變體微管蛋白
綜上，研究利用AlphaFold2的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)功能，借助split-GFP熒光標(biāo)記技術(shù)發(fā)展了微管蛋白的功能型熒光標(biāo)記新方法，能夠在不影響微管蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的前提下對(duì)其進(jìn)行活細(xì)胞標(biāo)記與示蹤，該方法在微管蛋白相關(guān)疾病的研究中展現(xiàn)出重要的應(yīng)用潛力與價(jià)值。
歐光朔教授為論文通訊作者，清華大學(xué)生命學(xué)院2021級(jí)博士生許凱銘為論文第一作者。清華大學(xué)楊雪瑞課題組的2018級(jí)博士生李志原，那潔課題組的2021級(jí)博士生毛林凡，歐光朔課題組的2023級(jí)博士生郭正陽等參與了項(xiàng)目部分研究。研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金委、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃以及許凱銘獲得的國(guó)家自然青年學(xué)生基礎(chǔ)研究項(xiàng)目等的支持。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002615
供稿：生命學(xué)院
編輯：李華山
審核：郭玲
