清華新聞網(wǎng)9月30日電 近日，清華大學(xué)藥學(xué)院秦為課題組、北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院王初課題組和陳興課題組研究開發(fā)了一種化學(xué)生物學(xué)新技術(shù)BRIEF，利用化學(xué)探針在活細(xì)胞中記錄特定外排泵的藥物外排過程，為理解藥物耐藥性提供了新的視角。
耐藥性在臨床藥物實(shí)踐中至關(guān)重要，它直接影響治療效果和患者預(yù)后。在細(xì)胞膜上存在著大量的外排泵通道蛋白，介導(dǎo)著外源藥物的排出。這些外排泵在癌細(xì)胞中過表達(dá)，造成了很多抗癌藥物的耐藥性。例如，近年來新興的蛋白降解靶向嵌合體（PROTAC）也會(huì)被外排泵排出，從而降低其胞內(nèi)濃度和藥效，為其臨床應(yīng)用帶來了較大挑戰(zhàn)。抑制外排泵可以提高對應(yīng)藥物的胞內(nèi)水平和療效，因此外排泵抑制劑與抗癌藥物聯(lián)合使用成為一種很有前景的化療策略。
ATP結(jié)合盒式蛋白（ABC）家族包含多種外排泵，它們介導(dǎo)了多種藥物的耐藥性。比較常見的如P-糖蛋白（P-gp或ABCB1）會(huì)阻礙藥物的細(xì)胞攝取，或多藥耐藥蛋白家族（MRPs或ABCC）會(huì)外排不同結(jié)構(gòu)特征的多種藥物。鑒定某種藥物具體由哪些外排泵所排出至關(guān)重要，但卻充滿挑戰(zhàn)。主要原因是不同外排泵的底物數(shù)量眾多且結(jié)構(gòu)迥異，例如MRP1（ABCC1）可以泵出數(shù)百種不同結(jié)構(gòu)的藥物，包括抗癌藥物長春花堿和重金屬陰離子；同時(shí)一些藥物可能是多個(gè)泵的底物，如黃芩苷，它同時(shí)由MRP3和MRP4運(yùn)輸。這使得通過結(jié)構(gòu)預(yù)測來判斷藥物是否為特定外排泵的底物十分困難，同時(shí)也缺乏高通量篩選手段在活細(xì)胞中鑒定可被特定外排泵排出的小分子藥物。
針對以上問題，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種生物正交報(bào)告抑制外排（bioorthogonal reporter inhibiting efflux，BRIEF）系統(tǒng)，用于評估活細(xì)胞中具有泵特異性的藥物外排。BRIEF中使用的生物正交外排探針（BEP）包含三個(gè)關(guān)鍵要素（圖1a）：（1）靶向特定外排泵的特異性底物支架，保障BEP的外排泵選擇性；（2）對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)標(biāo)記的反應(yīng)元件；（3）可通過點(diǎn)擊化學(xué)進(jìn)行熒光檢測的檢測元件。
在BRIEF實(shí)驗(yàn)中，如果待檢測藥物和BEP通過了相同外排泵，會(huì)產(chǎn)生競爭效應(yīng)導(dǎo)致BEP外排減少，從而增加BEP的胞內(nèi)濃度及其蛋白質(zhì)標(biāo)記強(qiáng)度（圖1b）。通過對細(xì)胞裂解物進(jìn)行點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)熒光基團(tuán)，可通過膠內(nèi)熒光檢測判斷細(xì)胞內(nèi)BEP水平（圖1c）。基于此，BRIEF技術(shù)將瞬時(shí)動(dòng)態(tài)的外排過程記錄為穩(wěn)定、可累積的化學(xué)標(biāo)記信號，便于后續(xù)檢測。
圖1.BRIEF的工作原理
為了驗(yàn)證BRIEF的可行性，首先需要發(fā)展特異的BEP探針。研究人員首先關(guān)注到了全乙酰化非天然糖探針（如Ac4GlcNAl），這類探針被廣泛應(yīng)用于糖質(zhì)代謝標(biāo)記研究糖基化的生物學(xué)功能。乙酰化保護(hù)顯著提高了非天然糖探針的疏水性和細(xì)胞膜通透性，但近年來也發(fā)現(xiàn)乙酰化保護(hù)造成了非天然糖探針與半胱氨酸的副反應(yīng)。由于此類疏水探針可能是外排泵的潛在底物，同時(shí)又具有特異的胞內(nèi)蛋白反應(yīng)活性，研究人員首先探究了全乙酰化非天然糖探針成為BEP的潛力。以Ac4GlcNAl探針為例，研究人員利用不同泵的抑制劑共同處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ABCC家族的抑制劑MK-571顯著提高了Ac4GlcNAl的標(biāo)記信號（圖2a）。這表明Ac4GlcNAl主要通過ABCC亞家族排出，因此研究人員分別敲低了ABCC的不同外排泵，發(fā)現(xiàn)了負(fù)責(zé)其外排的外排泵為ABCC3，4，10和12，因此Ac4GlcNAl可以作為這些外排泵的BEP探針。研究人員隨后選擇了此類外排泵的已知底物黃芩苷來測試其對Ac4GlcNAl的外排競爭效果。結(jié)果顯示在不同的細(xì)胞系中，黃芩苷處理都會(huì)增加Ac4GlcNAl的標(biāo)記強(qiáng)度（圖2b）。研究人員隨后篩選了其他黃酮類化合物，發(fā)現(xiàn)槲皮素、芹菜素和黃芩素也都是潛在的ABCC底物（圖2c）。
圖2.基于非天然糖探針的BRIEF策略驗(yàn)證
研究人員進(jìn)一步基于BRIEF建立小分子藥物的外排篩選平臺，對409種天然產(chǎn)物的外排情況進(jìn)行了篩選鑒定（圖3a），從而發(fā)現(xiàn)了單寧酸、沒食子酸和膽固醇這三種天然小分子可以由ABCC外排泵所排出（圖3b）。其中單寧酸對Ac4GlcNAl標(biāo)記信號的提高最為明顯，研究人員進(jìn)一步驗(yàn)證了ABCC的抑制劑是否可以增強(qiáng)單寧酸的藥用活性。單寧酸已知具有抑制癌細(xì)胞增殖和抗SARS-COV-2的活性，研究人員發(fā)現(xiàn)結(jié)合ABCC抑制劑MK-571處理，可以顯著提高單寧酸的抑癌活性（圖3c）和抗SARS-COV-2的活性（圖3d）。
圖3.ABCC外排泵的藥物外排篩選
研究人員最后驗(yàn)證了BRIEF策略的普適性，發(fā)展了針對P-gp（ABCB1）外排泵的BEP探針。羅丹明123已知可以被ABCB1外排，同時(shí)它具有光催化鄰近標(biāo)記的反應(yīng)活性。研究人員因此選用羅丹明123作為ABCB1的BEP探針（圖4），并同樣進(jìn)行了活細(xì)胞內(nèi)的底物篩選，發(fā)現(xiàn)了二氫茉莉酸甲酯作為新的P-gp底物，證明了BRIEF策略的普適性。綜上所述，BRIEF方法提供了一個(gè)通用的、可擴(kuò)展的活細(xì)胞篩選平臺，通過對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的化學(xué)標(biāo)記來監(jiān)測藥物外排情況。
圖4.基于光催化鄰近標(biāo)記的BRIEF策略檢測P-糖蛋白介導(dǎo)的藥物外排
9月26日，相關(guān)研究成果以“活細(xì)胞中外排泵特異藥物外排的化學(xué)記錄”（Chemical recording of pump-specific drug efflux in living cells）為題，在《德國應(yīng)用化學(xué)》（Angewandte Chemie International Edition）上發(fā)表。
清華大學(xué)藥學(xué)院助理教授秦為，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院教授王初、陳興為論文的共同通訊作者。清華大學(xué)藥學(xué)院博士生孫雪歌、北京大學(xué)博士畢業(yè)生陳影（現(xiàn)為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所助理教授）為論文的共同第一作者。清華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院副教授丁強(qiáng)為研究提供了重要實(shí)驗(yàn)幫助。清華大學(xué)藥學(xué)院博士生楊晨、博士后潘宣圳，北京大學(xué)博士畢業(yè)生楊嵩、林瑋（現(xiàn)為加州大學(xué)圣迭戈分校博士后）、全柏嶧為研究提供了重要實(shí)驗(yàn)幫助。清華大學(xué)藥學(xué)院劉剛課題組提供了細(xì)胞系和小分子藥物支持。清華大學(xué)藥學(xué)院活性篩選平臺提供了篩選技術(shù)支持。研究得到國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心、清華大學(xué)篤實(shí)計(jì)劃、北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心、北京分子科學(xué)國家實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究基金等的支持。
論文鏈接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202409282
供稿：藥學(xué)院
編輯：李華山
審核：郭玲
