清華新聞網(wǎng)10月24日電 2022年爆發(fā)的猴痘疫情已蔓延至全球123個國家和地區(qū)，截至2024年9月，實驗室確認的感染病例累計已超10.9萬例，導致236人死亡。世界衛(wèi)生組織在2022年和2024年兩度就猴痘疫情發(fā)布最高級別預(yù)警，宣布其構(gòu)成“國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”（public health emergency of international concern, PHEIC）。
猴痘病毒是一種直徑可達350nm的巨型囊膜病毒。它擁有近200kbp的雙鏈DNA基因組，編碼了180余種蛋白質(zhì)，相較于其他病毒而言組分構(gòu)成極其復(fù)雜且體型龐大。加之其高致病性及傳染性特征，至今尚無完整、真實猴痘病毒粒子的冷凍電鏡照片或結(jié)構(gòu)公開。
10月22日，清華大學生命學院李賽課題組與中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所應(yīng)急技術(shù)中心譚文杰團隊合作，以“猴痘成熟病毒粒子的分子構(gòu)造”（Molecular Architecture of Monkeypox Mature Virus）為題在《細胞·發(fā)現(xiàn)》（Cell Discovery）發(fā)文，揭示了滅活猴痘病毒成熟病毒粒子及其內(nèi)核上柵欄蛋白與孔道復(fù)合物的原位結(jié)構(gòu)與組裝模式，并首次報道了2022-2023年流行的兩個代表性猴痘病毒毒株中存在異常組裝模式的現(xiàn)象。
研究團隊在中國疾病預(yù)防控制中心BSL-3實驗室內(nèi)分離培養(yǎng)猴痘病毒并充分滅活。滅活樣品經(jīng)多輪驗證并確認完全失去感染性后，被密封運送至清華大學BSL-2實驗室進行實驗。為了在保留真實病毒形貌的同時克服成像襯度、樣品豐度等方面的挑戰(zhàn)，研究團隊優(yōu)化調(diào)整了病毒粒子的提純方案，得到高純度、高豐度、高分散性、無感染性但又保留了完整病毒形態(tài)的猴痘病毒粒子樣品。團隊首先對中國大陸首個輸入性病例的猴痘病毒毒株（clade IIb B.1）進行了冷凍電子斷層成像（cryo-ET），發(fā)現(xiàn)大部分病毒粒子呈“圓餅”狀，其長軸和短軸長度約為310nm和270nm。病毒的基因組被包裹在一個完整的、形似紅細胞的兩面凹內(nèi)核中，內(nèi)核壁由外層的柵欄狀蛋白和下方的內(nèi)壁蛋白組成；在內(nèi)核的兩側(cè)各有一個含大量蛋白的側(cè)體，側(cè)體和內(nèi)核一起被包裹在一層囊膜內(nèi)，囊膜表面覆有密集的病毒刺突蛋白（圖1）。
圖1.猴痘病毒成熟病毒粒子的冷凍電子斷層圖像（正面及側(cè)面）
通過子斷層平均（sub-tomogram averaging）方法，團隊解析了這些常規(guī)形態(tài)病毒粒子內(nèi)核上柵欄蛋白的原位結(jié)構(gòu)（圖2，i）。該結(jié)構(gòu)在整體上與Alphafold2預(yù)測的A10三聚體擬合良好，但局部體現(xiàn)出一定的差異性。首先，其頂部橫截面處可見每個A10單體亞基側(cè)面均存在一未知的多余密度與相鄰亞基相連。其次，其中心橫截面處未呈現(xiàn)出預(yù)測的連接密度。前人研究已發(fā)現(xiàn)該連接密度在痘苗病毒（VACV）的柵欄蛋白中真實存在。結(jié)合猴痘病毒與痘苗病毒的序列比較，推測該結(jié)構(gòu)差異可能與猴痘病毒在兩亞基相互作用界面上攜帶的氨基酸突變導致的電荷變化有關(guān)。
通過分析柵欄蛋白的組裝規(guī)律，研究團隊發(fā)現(xiàn)它們可靈活地排布成單元間距約為9nm的蜂巢狀結(jié)構(gòu)（圖2，ii）。在內(nèi)核上，團隊也發(fā)現(xiàn)了花朵狀的孔道復(fù)合體（圖2，iii）。這些孔道復(fù)合體由六個柵欄蛋白圍繞一個孔道復(fù)合體構(gòu)成，并局部擾亂周邊柵欄蛋白的蜂巢狀排列模式。這些看似隨機分布的花朵狀孔道復(fù)合體可能與病毒早期轉(zhuǎn)錄階段的物質(zhì)進出有關(guān)。
圖2.猴痘病毒內(nèi)核表面柵欄蛋白與孔道復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和組裝模式
基于解析得到的蛋白結(jié)構(gòu)和分布，團隊將一顆代表性猴痘成熟病毒粒子進行重構(gòu)，得到病毒分子構(gòu)造模型（圖3）。該模型在分子層面展示了真實猴痘成熟病毒粒子的結(jié)構(gòu)和組裝規(guī)律。
圖3.代表性猴痘病毒成熟病毒粒子的分子構(gòu)造模型
然而，以上所示的常規(guī)形態(tài)猴痘病毒僅占據(jù)全部病毒粒子約60%的比例，其余近40%病毒粒子則與以往報道的正痘病毒形態(tài)不同，其內(nèi)核壁折疊成扁平囊狀、卷曲層狀或形成多個獨立的小核，病毒內(nèi)部的內(nèi)核構(gòu)造并不似紅細胞一樣閉合且雙面凹陷。
圖4.異常形態(tài)猴痘病毒粒子的電子斷層圖像與內(nèi)核壁折疊模式
為了判斷異常形態(tài)病毒是否廣泛存在，研究團隊又對C.1毒株進行了同樣的觀測。這一毒株分離自中國大陸首例本土傳播病例，其出現(xiàn)晚于B.1毒株，自2023年中逐漸成為主要流行毒株之一。研究團隊發(fā)現(xiàn)，盡管C.1毒株也存在類似的異常形態(tài)顆粒，其出現(xiàn)率卻顯著低于B.1毒株（圖5）。這表明該毒株的內(nèi)核組裝成功率顯著提升，一定程度上反映出伴隨著2022-2023年的流行傳播，clade IIb猴痘病毒可能發(fā)生了適應(yīng)性進化并逐漸形成了更加高效的內(nèi)核組裝機制。
圖5.C.1毒株中異常形態(tài)猴痘病毒粒子出現(xiàn)率顯著低于B.1毒株
研究通過揭示真實猴痘病毒的分子構(gòu)造，發(fā)現(xiàn)2022年至今主要流行的兩個代表性毒株存在不同比例的異常形態(tài)病毒粒子，提示猴痘病毒在內(nèi)核組裝方面可能發(fā)生了適應(yīng)性進化。然而其他猴痘病毒分支與毒株，特別是2024年8月爆發(fā)的cladeIb分支毒株是否存在類似特征，這些異形病毒顆粒的形成機制，及這些毒株的形態(tài)是否和致病性存在關(guān)聯(lián)等問題還有待進一步探索。此外，本研究主要揭示了猴痘病毒內(nèi)核表面的分子構(gòu)造，但更多結(jié)構(gòu)細節(jié)，如內(nèi)核中基因組如何組裝、囊膜表面刺突蛋白的結(jié)構(gòu)和分布規(guī)律，猴痘主要抗原與受體、中和抗體的結(jié)合機制等是下一步的研究重點。
清華大學生命學院、北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心、清華-北大生命聯(lián)合中心、膜生物學國家重點實驗室李賽副教授和中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所應(yīng)急技術(shù)中心譚文杰主任為論文共同通訊作者。清華大學生命學院2021級博士生洪燁、中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所應(yīng)急技術(shù)中心黃保英研究員和清華大學生命學院、清華-北大生命聯(lián)合中心博士后張俊霞博士為論文共同第一作者。李賽課題組2020級博士生彭程和2021級博士生孔維正參與了部分工作。
研究得到國家蛋白質(zhì)科學研究（北京）設(shè)施清華基地冷凍電鏡平臺，生物計算平臺，細胞影像平臺和公共生物安全二級實驗平臺的技術(shù)支持。同時得到國家自然科學基金、清華大學春風基金、清華大學篤實基金、清華-北大生命聯(lián)合中心、北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心、膜生物學國家重點實驗室等支持。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41421-024-00741-5
供稿：生命學院
編輯：李華山
審核：郭玲
