清華新聞網1月3日電 CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種廣泛應用的基因編輯工具，該系統(tǒng)通過引導RNA（gRNA）引導Cas蛋白識別并切割靶標DNA。近年來，隨著生物信息學和生物化學研究的深入，CRISPR系統(tǒng)的多樣性得到了極大擴展，尤其是在第V型家族中，這類系統(tǒng)依賴于高度保守的RuvC核酸酶結構域來實現靶標切割。作為第V型家族的一個獨特亞型，CRISPR-Cas12e（也稱為CasX）以其較小的分子尺寸和高效的基因編輯潛力而備受關注。已鑒定的DpbCas12e和PlmCas12e同源蛋白在蛋白序列和結構方面高度保守。不久之前，清華大學生命學院陳春來與劉俊杰（Gogo）課題組合作揭示了二者在靶標搜索和切割過程的動態(tài)調控機制。然而，CRISPR-Cas12e系統(tǒng)的進化豐富性，以及功能和結構的差異性長期以來缺乏系統(tǒng)性的研究。
2024年12月30日，劉俊杰課題組再次聯(lián)合陳春來課題組以及北京大學現代農業(yè)研究院的蘇丁丁課題組在《自然·通訊》（Nature Communications）發(fā)表了題為“Cas12e同源蛋白進化出多樣的結構特征來促進雙鏈DNA的解旋”（Cas12e orthologs evolve variable structural features to facilitate dsDNA cleavage）的研究論文。這項研究系統(tǒng)地鑒定了六種新型Cas12e同源蛋白，通過結構生物學和生化實驗系統(tǒng)解析了這些蛋白在識別DNA靶標、雙鏈DNA解旋和切割中的獨特機制。
研究團隊通過生物信息學分析出六種新的Cas12e同源蛋白，其大小在818-920個氨基酸殘基（圖1）。從預測的結構上分析，這些蛋白的非靶標鏈結合（NTSB）結構域有明顯差別。生化實驗表明，Cas12e蛋白偏好識別富含T或C的PAM序列，并且表現出多樣的靶向DNA干擾能力。利用單分子FRET實驗，研究進一步發(fā)現，Cas12e蛋白的切割效率與鹽濃度密切相關。在低鹽條件下，這些蛋白表現出更高的R-loop形成能力和切割活性，而高鹽條件則會顯著抑制其活性（圖1）。這一結果揭示了鹽濃度對Cas12e功能的調控作用，并為其在復雜環(huán)境中的應用優(yōu)化提供了指導。
圖1.新型CRISPR-Cas12e系統(tǒng)的結構和生化活性
進一步，課題組通過單顆粒冷凍電鏡技術解析了VemCas12e和LesCas12e的三元復合體結構。分析發(fā)現，在高鹽條件下，同源蛋白間不同的R-loop形成能力和Cas蛋白中負責解旋DNA雙鏈的結構有關（圖2）。部分Cas12e蛋白（如PlmCas12e和DpbCas12e）含有獨特NTSB結構域。這一結構域能夠在高鹽條件下促進DNA解旋而增強切割活性。相比之下，缺乏該結構域的Cas12e蛋白（如VemCas12e和LesCas12e）則依賴富含正電氨基酸殘基的短肽環(huán)結構（如Loop 1和Loop 2）進行DNA解旋，但其對R-loop形成的促進作用相對較小，因而切割效率相對較低。總之，能夠在高鹽濃度條件下促進R-loop穩(wěn)定形成的結構有利于實現更高的DNA雙鏈切割活性。與此相符的是，Plm2Cas12e蛋白的NTSB結構域缺乏一些和非靶標鏈（NTS）、靶標鏈（TS）相互作用的關鍵氨基酸殘基，因而在高鹽濃度的條件下表現出較低的雙鏈切割活性；而OpbCas12e蛋白在RuvC核酸酶結構域具有一個能夠促進R-loop形成的Helix-loop結構，從而在高鹽濃度的條件下有相對更高的雙鏈切割活性（圖1）。這些結構差異揭示了Cas12e家族的功能多樣性的結構基礎。
圖2.不同Cas12e蛋白參與解旋PAM附近雙鏈區(qū)域的結構
最后，研究從進化的角度描述了Cas12e家族蛋白如何通過獲得不同的結構元件，以及相應gRNA的多樣性來適應多樣化的環(huán)境條件，從而提高其切割活性（圖3）。這些發(fā)現為未來Cas12e系統(tǒng)的優(yōu)化和基因編輯工具的開發(fā)提供了全新思路，也對理解CRISPR-Cas系統(tǒng)的演化機制具有重要意義。
圖3. CRISPR-Cas12e家族的蛋白和引導RNA的進化多樣性
在本研究中，Cas12e同源蛋白展現出了多樣的單鏈DNA反式切割活性，其中PlmCas12e具有最高效的反式切割活性。當鹽濃度降低時，其活性進一步增強。這些結果展現了Cas12e家族蛋白在核酸檢測中的巨大潛力，并為優(yōu)化其檢測性能提供了理論基礎。
劉俊杰副教授、陳春來副教授和蘇丁丁研究員為本文共同通訊作者；清華大學生命學院2018級博士生李丹苑、博士后張壽悅（現為中科院微生物研究所研究員）、2023級博士生林鑠和2018級博士生邢文婧為本文共同第一作者。清華大學生命學院2019級博士生楊韻和北京大學現代農業(yè)研究院2022級碩士生朱鳳霞也參與了研究。研究得到國家科技部腦科學項目、國家重點研發(fā)計劃、中華人民共和國農業(yè)農村部、國家自然科學基金等的經費支持。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41467-024-54491-9
供稿：生命學院
編輯：李華山
審核：郭玲
