清華新聞網(wǎng)1月3日電 CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種廣泛應(yīng)用的基因編輯工具,，該系統(tǒng)通過引導(dǎo)RNA（gRNA）引導(dǎo)Cas蛋白識別并切割靶標(biāo)DNA。近年來,，隨著生物信息學(xué)和生物化學(xué)研究的深入,，CRISPR系統(tǒng)的多樣性得到了極大擴展，尤其是在第V型家族中,，這類系統(tǒng)依賴于高度保守的RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域來實現(xiàn)靶標(biāo)切割,。作為第V型家族的一個獨特亞型，CRISPR-Cas12e（也稱為CasX）以其較小的分子尺寸和高效的基因編輯潛力而備受關(guān)注。已鑒定的DpbCas12e和PlmCas12e同源蛋白在蛋白序列和結(jié)構(gòu)方面高度保守,。不久之前,，清華大學(xué)生命學(xué)院陳春來與劉俊杰（Gogo）課題組合作揭示了二者在靶標(biāo)搜索和切割過程的動態(tài)調(diào)控機制。然而,，CRISPR-Cas12e系統(tǒng)的進化豐富性,，以及功能和結(jié)構(gòu)的差異性長期以來缺乏系統(tǒng)性的研究。
2024年12月30日,，劉俊杰課題組再次聯(lián)合陳春來課題組以及北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院的蘇丁丁課題組在《自然·通訊》（Nature Communications）發(fā)表了題為“Cas12e同源蛋白進化出多樣的結(jié)構(gòu)特征來促進雙鏈DNA的解旋”（Cas12e orthologs evolve variable structural features to facilitate dsDNA cleavage）的研究論文,。這項研究系統(tǒng)地鑒定了六種新型Cas12e同源蛋白，通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生化實驗系統(tǒng)解析了這些蛋白在識別DNA靶標(biāo),、雙鏈DNA解旋和切割中的獨特機制,。
研究團隊通過生物信息學(xué)分析出六種新的Cas12e同源蛋白，其大小在818-920個氨基酸殘基（圖1）,。從預(yù)測的結(jié)構(gòu)上分析,，這些蛋白的非靶標(biāo)鏈結(jié)合（NTSB）結(jié)構(gòu)域有明顯差別。生化實驗表明,，Cas12e蛋白偏好識別富含T或C的PAM序列,，并且表現(xiàn)出多樣的靶向DNA干擾能力。利用單分子FRET實驗,，研究進一步發(fā)現(xiàn),，Cas12e蛋白的切割效率與鹽濃度密切相關(guān)。在低鹽條件下,，這些蛋白表現(xiàn)出更高的R-loop形成能力和切割活性,，而高鹽條件則會顯著抑制其活性（圖1）。這一結(jié)果揭示了鹽濃度對Cas12e功能的調(diào)控作用,，并為其在復(fù)雜環(huán)境中的應(yīng)用優(yōu)化提供了指導(dǎo),。
圖1.新型CRISPR-Cas12e系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和生化活性
進一步，課題組通過單顆粒冷凍電鏡技術(shù)解析了VemCas12e和LesCas12e的三元復(fù)合體結(jié)構(gòu),。分析發(fā)現(xiàn),，在高鹽條件下，同源蛋白間不同的R-loop形成能力和Cas蛋白中負(fù)責(zé)解旋DNA雙鏈的結(jié)構(gòu)有關(guān)（圖2）,。部分Cas12e蛋白（如PlmCas12e和DpbCas12e）含有獨特NTSB結(jié)構(gòu)域,。這一結(jié)構(gòu)域能夠在高鹽條件下促進DNA解旋而增強切割活性。相比之下,，缺乏該結(jié)構(gòu)域的Cas12e蛋白（如VemCas12e和LesCas12e）則依賴富含正電氨基酸殘基的短肽環(huán)結(jié)構(gòu)（如Loop 1和Loop 2）進行DNA解旋,，但其對R-loop形成的促進作用相對較小，因而切割效率相對較低,?？傊?，能夠在高鹽濃度條件下促進R-loop穩(wěn)定形成的結(jié)構(gòu)有利于實現(xiàn)更高的DNA雙鏈切割活性。與此相符的是,，Plm2Cas12e蛋白的NTSB結(jié)構(gòu)域缺乏一些和非靶標(biāo)鏈（NTS）,、靶標(biāo)鏈（TS）相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基，因而在高鹽濃度的條件下表現(xiàn)出較低的雙鏈切割活性,；而OpbCas12e蛋白在RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域具有一個能夠促進R-loop形成的Helix-loop結(jié)構(gòu),，從而在高鹽濃度的條件下有相對更高的雙鏈切割活性（圖1）,。這些結(jié)構(gòu)差異揭示了Cas12e家族的功能多樣性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),。
圖2.不同Cas12e蛋白參與解旋PAM附近雙鏈區(qū)域的結(jié)構(gòu)
最后，研究從進化的角度描述了Cas12e家族蛋白如何通過獲得不同的結(jié)構(gòu)元件,，以及相應(yīng)gRNA的多樣性來適應(yīng)多樣化的環(huán)境條件,，從而提高其切割活性（圖3）。這些發(fā)現(xiàn)為未來Cas12e系統(tǒng)的優(yōu)化和基因編輯工具的開發(fā)提供了全新思路,，也對理解CRISPR-Cas系統(tǒng)的演化機制具有重要意義,。
圖3. CRISPR-Cas12e家族的蛋白和引導(dǎo)RNA的進化多樣性
在本研究中，Cas12e同源蛋白展現(xiàn)出了多樣的單鏈DNA反式切割活性,，其中PlmCas12e具有最高效的反式切割活性,。當(dāng)鹽濃度降低時，其活性進一步增強,。這些結(jié)果展現(xiàn)了Cas12e家族蛋白在核酸檢測中的巨大潛力,，并為優(yōu)化其檢測性能提供了理論基礎(chǔ)。
劉俊杰副教授,、陳春來副教授和蘇丁丁研究員為本文共同通訊作者,；清華大學(xué)生命學(xué)院2018級博士生李丹苑、博士后張壽悅（現(xiàn)為中科院微生物研究所研究員）,、2023級博士生林鑠和2018級博士生邢文婧為本文共同第一作者,。清華大學(xué)生命學(xué)院2019級博士生楊韻和北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院2022級碩士生朱鳳霞也參與了研究。研究得到國家科技部腦科學(xué)項目,、國家重點研發(fā)計劃,、中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、國家自然科學(xué)基金等的經(jīng)費支持,。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41467-024-54491-9
供稿：生命學(xué)院
編輯：李華山
審核：郭玲
