清華新聞網(wǎng)1月8日電 膜融合是細(xì)胞內(nèi)最重要的生命活動之一。保守的SNARE家族蛋白通過形成高度穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體介導(dǎo)膜融合。SNARE復(fù)合體必須被解聚成單體以便循環(huán)使用，而這依賴于ATP酶NSF蛋白。NSF通過適配蛋白SNAP與SNARE復(fù)合體結(jié)合形成20S復(fù)合體，隨后水解ATP產(chǎn)生能量將SNARE復(fù)合體解聚。自1998年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)NSF以來，NSF解聚SNARE復(fù)合體的工作機(jī)制一直是研究熱點(diǎn)。雖然已有20S復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，但由于缺少解聚中間態(tài)的信息，SNARE復(fù)合體解聚的機(jī)制依舊不清楚。
1月2日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院隋森芳課題組與陳春來課題組合作，在《自然·通訊》（Nature Communications）雜志發(fā)表了題目為“單分子雙色和三色FRET研究揭示了NSF解聚SNARE復(fù)合體過程中的過渡態(tài)”（Single-molecule two- and three-colour FRET studies reveal a transition state in SNARE disassembly by NSF）的研究論文，澄清了SNARE解聚的順序問題。
研究人員首次利用單分子三色FRET技術(shù)在接近生理環(huán)境（即膜存在的條件）下監(jiān)測NSF解聚SNARE復(fù)合體的過程，這一實(shí)驗(yàn)方案在硬件、生化樣品制備和數(shù)據(jù)處理方面都極具挑戰(zhàn)性。通過biotin標(biāo)記的磷脂組裝的納米盤將SNARE復(fù)合體固定在玻片上，組成SNARE復(fù)合體的三個蛋白（Syntaxin、Vamp和SNAP25）分別標(biāo)記上Cy3、Cy5和Cy7熒光染料，基于研究人員的設(shè)計(jì)，在所有三個FRET對之間都有很高的FRET效率。隨后加入NSF、a-SNAP、ATP、Mg2+啟動反應(yīng)，同時使用全內(nèi)反射顯微鏡記錄熒光信號，根據(jù)信號的軌跡獲取動態(tài)信息（圖1）。基于方法上的進(jìn)步，以及同時捕獲三個蛋白運(yùn)動的精妙實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究人員能夠捕捉到比早先報道更豐富的信息。他們觀察到SNARE復(fù)合體的解聚存在兩條主要路徑。一條路徑是Syntaxin首先以可觀察到的瞬時狀態(tài)在N端與復(fù)合物的其余部分分離，然后完全解離。另一條路徑是VAMP首先與Syntaxin和SNAP25解離（圖2）。這個實(shí)驗(yàn)結(jié)果澄清了領(lǐng)域內(nèi)的一個重要問題，即SNARE復(fù)合體的解聚主要是一個依次解離的過程，而不是以前報道的同時解離的方式。
圖1.單分子三色FRET實(shí)驗(yàn)流程示意圖（a）和典型的熒光軌跡（b）和（c）
圖2. NSF解聚SNARE復(fù)合體的兩條主要路徑示意圖
生命學(xué)院隋森芳教授、陳春來副教授和孫珊副研究員為論文共同通訊作者。生命學(xué)院已出站博士后蘇德希爾·切帕利（Sudheer K. Cheppali）、2019級博士生李暢、2018級博士生邢文婧（已畢業(yè)）為論文共同第一作者。研究得到國家自然科學(xué)基金委、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心、膜生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等的經(jīng)費(fèi)資助。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41467-024-55531-0
供稿：生命學(xué)院
編輯：李華山
審核：郭玲
