清華新聞網(wǎng)3月19日電 Caspase-4（半胱天冬酶-4）是炎癥性caspase家族的重要成員，在人類固有免疫應答中發(fā)揮關(guān)鍵作用,。它通過直接識別革蘭氏陰性菌脂多糖（LPS）激活非經(jīng)典炎癥通路,，進而切割Gasdermin D（GSDMD）并介導細胞焦亡（pyroptosis）和炎癥因子釋放。盡管底物鑒定對解析Caspase-4的生物學功能與調(diào)控網(wǎng)絡至關(guān)重要,，但由于酶-底物相互作用瞬時性及切割效率低下等挑戰(zhàn),，傳統(tǒng)基于酶切產(chǎn)物富集的方法難以系統(tǒng)揭示其底物譜系。
近日,，清華大學藥學院尹航課題組創(chuàng)新性地將基因密碼子擴展與光交聯(lián)蛋白質(zhì)組學結(jié)合,，開發(fā)了一種高效捕獲Caspase底物的新方法。該技術(shù)突破了傳統(tǒng)酶活性依賴策略的局限性,，為焦亡及相關(guān)信號通路研究提供了強有力的工具,。
研究人員基于Caspase-4與底物GSDMD的互作界面,，利用基因密碼子擴展技術(shù)，將光敏非天然氨基酸pBpa精準嵌入Caspase-4的底物結(jié)合區(qū)域（K356位點）,，構(gòu)建了光交聯(lián)探針CASP4（C258A）-3C-pBpa,。并巧妙引入三重功能模塊：第一，通過C258A催化位點突變消除蛋白酶活性,，避免底物降解導致的信號丟失,；第二，插入HRV-3C蛋白酶切割位點維持天然構(gòu)象與底物結(jié)合能力,；第三,，利用pBpa的光交聯(lián)特性共價鎖定瞬時相互作用。該探針成功克服傳統(tǒng)方法的技術(shù)瓶頸,，實現(xiàn)了對弱結(jié)合底物的高效捕獲,。
圖1.光交聯(lián)探針設計與驗證
研究人員首先采用高分辨質(zhì)譜等技術(shù)對構(gòu)建的光交聯(lián)探針進行分子表征，確認探針的分子量及結(jié)構(gòu)完整性,。通過底物切割實驗與蛋白質(zhì)互作分析,，證實探針的結(jié)構(gòu)修飾（包括催化位點失活突變與蛋白酶切位點插入）未影響Caspase-4的天然構(gòu)象與功能特性。體外交聯(lián)實驗顯示,，該探針能夠在紫外激活下高效捕獲已知底物GSDMD,，并系統(tǒng)性富集裂解液中的相互作用蛋白，展現(xiàn)出顯著優(yōu)于傳統(tǒng)方法的底物捕獲能力,。
結(jié)合定量蛋白質(zhì)組學（Label-Free Quantification, LFQ）,，研究人員從THP-1細胞裂解液中鑒定出156種潛在底物。為驗證技術(shù)可靠性,，研究人員選取部分候選蛋白進行體外切割實驗,，證實了包括AKT1、CASP5/12在內(nèi)的16種蛋白可被Caspase-4切割,。這些實驗結(jié)果不僅驗證了光交聯(lián)探針技術(shù)的高效性與準確性,，更通過新底物的發(fā)現(xiàn)為解析焦亡通路中酶-底物結(jié)合特異性、信號交叉調(diào)控等關(guān)鍵科學問題提供了重要線索,。
圖2.組學分析與底物驗證
在眾多新發(fā)現(xiàn)的底物中,，尤其值得關(guān)注的是，研究首次揭示Caspase-4可通過特異性切割AKT1的D108位點,，移除其PH自抑制結(jié)構(gòu)域,，釋放激酶活性核心。這一發(fā)現(xiàn)提示細胞焦亡通路可能通過AKT1調(diào)控網(wǎng)絡與細胞存活,、代謝等進程產(chǎn)生交叉對話,。此外，Caspase-4對同家族蛋白酶Caspase-5/12前體的激活作用，揭示了炎癥性caspase間存在級聯(lián)放大機制,，為先天免疫應答調(diào)控提供了新視角,。
該研究通過技術(shù)創(chuàng)新與方法學突破，成功構(gòu)建了具有光親和能力的Caspase-4光交聯(lián)探針系統(tǒng),，解決了caspase底物鑒定的關(guān)鍵難題,。研究不僅系統(tǒng)擴展了Caspase-4的底物譜系，更揭示了其通過切割AKT1等關(guān)鍵調(diào)控蛋白實現(xiàn)焦亡通路與細胞穩(wěn)態(tài)網(wǎng)絡的跨維度對話,，以及通過激活同源蛋白酶形成級聯(lián)放大效應的新機制,。這些發(fā)現(xiàn)為深入解析細胞焦亡的分子調(diào)控網(wǎng)絡、闡明感染性疾病與炎癥相關(guān)疾病的發(fā)病機理提供了重要理論依據(jù),，同時發(fā)展的技術(shù)平臺為其他瞬時弱相互作用酶-底物系統(tǒng)的研究提供了普適性解決方案,。
相關(guān)研究成果以“位點特異性光交聯(lián)蛋白質(zhì)組學方法解析焦亡關(guān)鍵酶Caspase-4底物網(wǎng)絡”（A Site-Specific Photo-Crosslinking Proteomics Approach Provides Insights into Non-Canonical Pyroptotic Caspase-4 Substrates）為題，于3月12日發(fā)表于《德國應用化學》（Angew.Chem.Int.Ed.）,。
清華大學化學系博士生周易為論文第一作者,，清華大學藥學院教授尹航為論文通訊作者。藥學院博士生張新宇參與了此項工作,。研究得到國家自然科學基金,、國家衛(wèi)健委基金,、北京市自然科學基金,、清華-北大生命科學聯(lián)合中心等的資助。
論文鏈接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202501535
供稿：藥學院
編輯：李華山
審核：郭玲
