清華新聞網(wǎng)3月20日電 細胞外蛋白（包括分泌蛋白與跨膜蛋白）在多細胞生物的生理調(diào)控中具有重要作用,，其通過介導細胞間通訊協(xié)調(diào)復雜生理過程。病理狀態(tài)下,，細胞外蛋白的異常表達或修飾與癌癥,、神經(jīng)退行性疾病及心血管疾病等發(fā)生發(fā)展密切相關。值得注意的是,，超過60%的FDA批準藥物靶向細胞外蛋白,，因此系統(tǒng)解析細胞外蛋白質(zhì)組對闡明生物過程分子機制、揭示疾病病理基礎及開發(fā)靶向治療策略具有重要意義,。
近年來,，盡管鄰近標記酶（proximity labeling enzymes）和小分子光催化劑技術的發(fā)展促進了細胞外蛋白質(zhì)組的解析，但這些方法的體內(nèi)應用仍存在局限性,。辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）的標記依賴具有細胞毒性的過氧化氫（圖1a）,，限制了其在活體動物中的直接使用；而生物素連接酶（如BioID和TurboID）雖然可以實現(xiàn)活體細胞內(nèi)蛋白的標記,，卻因細胞外微環(huán)境中ATP濃度不足導致胞外標記效率受限。此外,，內(nèi)源性生物素或過氧化氫均可能出現(xiàn)較高的背景干擾,。可見光在活體組織中的穿透深度有限,，光催化劑在體內(nèi)的應用也面臨挑戰(zhàn),。
近日，清華大學藥學院秦為課題組研究開發(fā)了一種無毒的鄰近標記技術TyroID,，實現(xiàn)了活體內(nèi)細胞外蛋白質(zhì)組的高時空分辨率解析,，該技術成功應用于活體腫瘤異種移植模型HER2鄰近蛋白動態(tài)解析、血漿蛋白代謝追蹤及小鼠海馬區(qū)特異性蛋白質(zhì)組標記,，解決了傳統(tǒng)鄰近標記技術解析細胞外蛋白質(zhì)組的活體兼容性問題,。
該研究發(fā)展了一種新型活體鄰近標記技術TyroID（圖1b），用于實現(xiàn)細胞外蛋白質(zhì)組的時空動態(tài)解析,。TyroID 技術的核心是基于植物或細菌來源的酪氨酸酶（tyrosinase）,，其可以將生物正交的苯酚底物氧化為高反應活性的鄰醌（o-quinone），特異性標記鄰近蛋白中半胱氨酸,、賴氨酸及組氨酸等親核氨基酸,。與傳統(tǒng)鄰近標記技術相比，TyroID無需依賴過氧化氫或可見光等外源激活條件,，僅需添加酚類底物即可完成原位標記,。
圖1.（a）過氧化物酶（如 APEX 和 HRP）標記示意圖；（b）TyroID標記示意圖
針對常規(guī)探針AP易滲入胞內(nèi)的缺陷，團隊開發(fā)了膜非通透型探針“AxxP”——通過引入四聚乙二醇連接臂阻斷跨膜擴散,。實驗證明,，75nM abmTYR聯(lián)合50μM AxxP能在30分鐘內(nèi)實現(xiàn)乳腺癌細胞表面蛋白的特異性標記，與膜標志物GLUT1呈高度共定位,，且維持生理狀態(tài)下的蛋白空間分布,。基于二甲基化定量蛋白質(zhì)組學,，TyroID系統(tǒng)成功鑒定315個高置信度細胞外蛋白,。通過super-TOPP-ABPP技術解析的修飾位點均位于蛋白胞外域，證明該方法具備解析跨膜蛋白拓撲結構的獨特能力,。該研究進一步將TyroID應用于HER2受體鄰近蛋白組解析,，通過抗體靶向策略識別出LGALS1、FUS等HER2互作蛋白,，并經(jīng)Co-IP實驗驗證其結合強度與經(jīng)典互作蛋白TFRC相當,。
最后，基于TyroID無毒,、快速標記的優(yōu)勢,，團隊探索了其在活體中的應用，這是基于過氧化物酶和可見光激活的鄰近標記方法難以實現(xiàn)的,。為此,，研究人員設計了三項獨立的活體實驗，以驗證TyroID在活體小鼠中應用的有效性：第一,，活體腫瘤中HER2鄰近蛋白的分析,，鑒定出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ATP酶（VCP）、鈣調(diào)理蛋白2（CNN2）及分選連接蛋白9（SNX9）等在細胞培養(yǎng)實驗中未發(fā)現(xiàn)的HER2鄰近蛋白,；第二,，定量分析44種血漿蛋白的turnover速率，揭示Apoc3,、Apoa4和Apoe等載脂蛋白的高代謝特性,；第三，海馬區(qū)原位標記叢蛋白A1（Plxna1）,、神經(jīng)軟骨蛋白（Ncdn）及神經(jīng)元膜糖蛋白M6-a（Gpm6a）等腦特異性蛋白,。
圖2.TyroID在活體內(nèi)的應用
綜上，TyroID通過酶促生成鄰醌實現(xiàn)無毒,、快速的細胞外標記,，突破了傳統(tǒng)技術對過氧化氫或可見光的依賴，為活體蛋白質(zhì)組動態(tài)解析提供了創(chuàng)新工具,。其在腫瘤微環(huán)境研究,、血漿蛋白周轉監(jiān)測及神經(jīng)生物學領域的應用,，展現(xiàn)了廣闊的研究潛力。
相關研究成果以“活體兼容鄰近標記技術TyroID解析細胞外蛋白質(zhì)組的時空動態(tài)”（Spatiotemporally resolved mapping of extracellular proteomes via in vivo-compatible TyroID）為題,，于3月15日發(fā)表于《自然·通訊》（Nature Communications）,。
清華-北大生命科學聯(lián)合中心、清華大學藥學院助理教授秦為為論文的通訊作者,，清華大學藥學院博士生張梓涓和博士后王妍坤為論文的第一作者,。中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所武照伐研究員為本文提供了重要實驗幫助。
研究得到國家重點研發(fā)計劃青年科學家項目,，國家自然科學基金重大研究計劃培育項目,、面上項目，中國博士后面上項目,，清華-北大生命科學聯(lián)合中心,，清華大學篤實計劃，北京生物結構前沿研究中心,，北京分子科學國家實驗室基礎研究基金,，深圳市醫(yī)學研究基金等的支持。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41467-025-57767-w
供稿：藥學院
編輯：李華山
審核：郭玲
