清華新聞網(wǎng)4月7日電 含硅有機物尤其是具有硅手性中心的化合物近年來在有機合成、功能材料及藥物化學領(lǐng)域展現(xiàn)出重要的應用價值，但其生物催化合成體系的發(fā)展仍顯著滯后于傳統(tǒng)化學方法。值得注意的是，盡管硅元素在地殼中的豐度高達28.8%（以二氧化硅和硅酸鹽形式存在），但是生命系統(tǒng)對其生物利用卻極為有限，僅有硅藻等少數(shù)生物進化出特異性硅代謝途徑。研究如何利用酶催化過程制備或者轉(zhuǎn)化含硅化合物是合成化學以及生物催化領(lǐng)域的熱點之一。近年來，相關(guān)領(lǐng)域的研究已經(jīng)取得了重要進展，其中代表性的工作如利用細胞色素c催化卡賓的硅氫鍵插入反應，以及利用細胞色素P450酶催化惰性硅氧烷添加劑中碳硅鍵氧化降解等。相關(guān)研究充分證明了酶工程在含硅化合物的制備以及轉(zhuǎn)化方面所具備的應用潛力，為發(fā)展綠色可持續(xù)的硅基材料合成技術(shù)開辟了新路徑。
盡管如此，現(xiàn)有生物催化體系尚未見直接構(gòu)建硅手性中心的成功案例。相關(guān)研究表明，許多含硅有機物（如α-硅醇類結(jié)構(gòu)）在水溶液中穩(wěn)定性較低，容易發(fā)生分解及消旋化。為了突破這一限制并填補領(lǐng)域空白，清華大學生物醫(yī)學交叉研究院劉臻課題組與浙江工業(yè)大學建筑工程學院楊云芳團隊合作，開發(fā)了基于P450氧化酶的去對稱化生物催化平臺。通過蛋白質(zhì)工程改造獲得的突變體，其酶活較野生型提高了54倍，可在短時間內(nèi)完成硅烷底物的選擇性氧化，從而有效規(guī)避產(chǎn)物分解與消旋化問題。4月3日，相關(guān)研究成員以“不對稱合成硅立體烷醇的酶促平臺”（An Enzymatic Platform for Asymmetric Synthesis of Si-Stereogenic Silanols）為題，發(fā)表于《德國應用化學》（Angewandte Chemie International Edition）。該研究利用源自Bacillus megaterium的野生型P450BM3酶為進化起點，首次實現(xiàn)了含硅手性中心（Si-stereogeniccenter）硅醇的酶催化合成。研究人員通過六輪迭代式的定向進化獲得了優(yōu)勢突變體ASOx-6，其催化效率（kcat/KM）較野生型提升54倍，可高效催化潛手性二氫硅烷的單氧化反應，獲得相應的手性硅醇產(chǎn)物。該平臺兼容多種芳基-烷基取代底物（包括含芳雜環(huán)的硅烷），模版底物的總催化轉(zhuǎn)化數(shù)（TTN）可達1450。此外，通過分子動力學模擬以及DFT計算的手段，結(jié)合機理實驗，研究人員系統(tǒng)闡明了該酶催化過程的反應機制。
圖1.手性硅醇的去對稱化合成策略
在研究的起始階段，研究人員首先對于一系列碳氫鍵羥化酶的硅烷氧化活性進行了篩選評估。實驗表明，P450氧化酶對于這一目標反應不僅具有顯著的初始活性以及中等的手性選擇性，更為重要的是，該催化體系中未檢測到二氫硅烷過度氧化的副產(chǎn)物硅烷二醇3a的生成。基于這一發(fā)現(xiàn)，研究人員隨后利用野生型P450酶作為母體，進行了多輪的定向進化。通過針對多個活性位點的定點飽和突變（site-saturation mutagenesis）以及隨機突變（random mutagenesis），研究人員最終找到了催化這一反應的高活性突變體ASOx-6。在僅使用0.56‰酶載量的條件下，其催化模型底物的效果為81%的收率以及90%的ee值。
圖2.關(guān)鍵酶的篩選與蛋白質(zhì)定向進化
隨后，研究人員對于該酶催化系統(tǒng)的底物適用性進行了系統(tǒng)評估。實驗表明，多種芳基-烷基取代的二氫硅烷化合物可以被ASOx-6選擇性氧化。底物的兼容性包括芳環(huán)上不同位置與電性的取代基，或者部分含有雜環(huán)的化合物。針對部分中等收率或者較低選擇性的底物，研究人員并未展開單獨的定向進化，但指出基于蛋白質(zhì)工程經(jīng)驗，可以通過類似的進化策略獲得針對性的突變體。
此外，放大反應驗證了該體系的合成潛力：分離的手性硅醇產(chǎn)物經(jīng)由鉑催化的硅氫化反應，可立體專一性轉(zhuǎn)化為具有生物活性的硅醇衍生物4a以及4b。
圖3.底物適用性拓展與合成應用探索
通過DFT計算，研究人員發(fā)現(xiàn)這一催化過程遵循與經(jīng)典碳氫鍵氧化體系相似的機制，包括氫原子攫取（Hydrogen-atom abstraction）以及氧回彈（Oxygen-rebound）等關(guān)鍵反應步驟。計算及競爭性KIE實驗確認了氫原子攫取為反應的產(chǎn)物決定步驟，然而由于硅氫鍵的鍵能顯著低于普通的碳氫鍵鍵能，在這一硅烷氧化體系中，該步驟并非反應的決速步。分子動力學模擬對比顯示：野生型P450BM3與最終變體ASOx-6的近攻擊（near-attack）構(gòu)象中，底物的pro-R氫原子均保持與鐵氧中間體較近的距離，而關(guān)鍵突變使pro-S氫在突變體中與氧中心的平均距離增加。這一變化直接決定了最終變體對于該反應更優(yōu)的對映選擇性。
圖4.基于密度泛函理論（DFT）進行的機理計算
總的來說，定向進化獲得的高效突變體ASOx-6是反應成功的關(guān)鍵。通過開發(fā)這一硅烷不對稱氧化酶催化體系，研究人員證明了不穩(wěn)定手性硅醇可以通過酶催化的手段獲得，為含有硅手性中心化合物的合成提供了高效、環(huán)境友好且立體可控的生物合成策略，有望在活性分子合成及硅基材料開發(fā)等領(lǐng)域獲得應用。
清華大學生物醫(yī)學交叉研究院研究員劉臻和浙江工業(yè)大學建筑工程學院研究員楊云芳為論文通訊作者，劉臻課題組博士生代雙玉為論文第一作者。該項目的實驗部分主要由代雙玉完成，計算部分主要由浙江工業(yè)大學建筑工程學院陳俠荷博士完成。研究得到科技部、國家自然科學基金委、浙江省屬高校基礎研究基金、清華大學生物醫(yī)學交叉研究院、浙江工業(yè)大學以及北京生命科學研究所的資助。
論文鏈接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/anie.202501524
供稿：生物醫(yī)學交叉研究院
編輯：李華山
審核：郭玲
