清華新聞網(wǎng)4月9日電 苯胺類化合物作為關(guān)鍵結(jié)構(gòu)單元，普遍存在于藥物分子及其他活性物質(zhì)中，同時(shí)是多種工業(yè)材料制備的核心中間體。透明度市場(chǎng)研究（Transparency Market Research）發(fā)布的《2021-2031年全球苯胺衍生物市場(chǎng)預(yù)測(cè)報(bào)告》顯示，到2031年，全球苯胺類衍生物的市場(chǎng)價(jià)值將達(dá)到110億美元。因此，開發(fā)芳胺骨架的高效合成方法在藥物開發(fā)和材料科學(xué)等領(lǐng)域至關(guān)重要。傳統(tǒng)的苯胺類化合物的工業(yè)合成工藝主要以苯或其衍生物出發(fā)，通過(guò)苯環(huán)硝基化反應(yīng)以及隨后的硝基苯催化加氫獲得苯胺。在醫(yī)藥中間體合成領(lǐng)域，過(guò)渡金屬催化的C–N鍵偶聯(lián)反應(yīng)同樣被廣泛應(yīng)用，這類方法的發(fā)展對(duì)于藥物分子的構(gòu)建具有關(guān)鍵意義。盡管這些經(jīng)典方法目前仍無(wú)可替代，科研工作者持續(xù)致力于探索更加綠色溫和、可持續(xù)的合成體系，從而最終避免使用高溫高壓的反應(yīng)條件，或者高成本且具有生理毒性的過(guò)渡金屬催化劑。本研究聚焦生物酶催化體系的開發(fā)，通過(guò)定向進(jìn)化初步驗(yàn)證了該策略合成苯胺類化合物的可行性。值得注意的是，相較于自然界中存在的基于P450體系的苯胺合成酶，這一生物催化體系展現(xiàn)出截然不同的催化機(jī)制，為酶催化在苯胺合成領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的突破方向。
4月7日，清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院劉臻課題組在《德國(guó)應(yīng)用化學(xué)》（Angewandte Chemie International Edition）發(fā)表了題為“氧化胺化合成苯胺的酶促平臺(tái)”（An Enzymatic Platform for Aniline Synthesis through Oxidative Amination）的研究論文。通過(guò)改造該實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的黃素（FMN）依賴酶PtOYE（源自Parageobacillus thermantarcticus），這一催化體系可以有效地將胺類化合物和環(huán)己酮衍生物組合，通過(guò)氧化胺化的機(jī)制制備多種二級(jí)和三級(jí)苯胺。針對(duì)結(jié)構(gòu)不同的胺類底物，研究人員分別通過(guò)兩條定向進(jìn)化路徑獲得了各自的優(yōu)勢(shì)突變體OYE_G3和OYE_M3，提高了酶催化的效率并抑制了環(huán)己酮直接脫氫生成苯酚的副反應(yīng)。通過(guò)多組動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，研究人員系統(tǒng)研究了這類苯胺合成酶的催化機(jī)制。實(shí)驗(yàn)表明，優(yōu)勢(shì)突變體不僅提高了亞胺中間體芳構(gòu)化的催化效率，且降低了環(huán)己酮直接脫氫生成苯酚的活性，形成了有利于目標(biāo)反應(yīng)的協(xié)同效應(yīng)。
圖1.苯胺類化合物的生物合成新策略
研究初期，研究人員首先對(duì)野生型黃素酶及其突變體的亞胺脫氫芳構(gòu)化活性進(jìn)行了系統(tǒng)性篩選。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，課題組現(xiàn)有酶庫(kù)中的OYE_G0突變體對(duì)于目標(biāo)反應(yīng)具有顯著的初始活性，能夠以最高的轉(zhuǎn)化率（38%）催化生成目標(biāo)產(chǎn)物3aa且目標(biāo)產(chǎn)物與副產(chǎn)物4a的比例最優(yōu)，體現(xiàn)了這類脫氫酶具有被進(jìn)一步優(yōu)化的潛力。
基于這一發(fā)現(xiàn)，研究人員隨后利用OYE_G0作為起始模版，分別針對(duì)二級(jí)苯胺和三級(jí)苯胺的合成過(guò)程進(jìn)行了多輪蛋白質(zhì)工程化改造與篩選。通過(guò)多個(gè)活性位點(diǎn)的定點(diǎn)飽和突變以及隨機(jī)突變，研究人員最終分別獲得催化合成二級(jí)苯胺的突變體OYE_G3以及催化合成三級(jí)苯胺的優(yōu)勢(shì)突變體OYE_M3。
圖2.針對(duì)二級(jí)與三級(jí)苯胺分別開展的蛋白質(zhì)工程化改造
在確定了最優(yōu)酶突變體和最適反應(yīng)條件之后，研究人員系統(tǒng)地研究了這些苯胺合成酶的底物適用范圍。結(jié)果表明，這種生物催化方法展示出了良好的底物兼容性和官能團(tuán)耐受性，可以將不同取代的芐胺、含雜環(huán)的伯胺以及部分烷基胺轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的二級(jí)苯胺；也可成功地將部分仲胺轉(zhuǎn)化為三級(jí)苯胺。此外，不同取代模式的環(huán)己酮也能參與反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，研究人員選取多個(gè)底物進(jìn)行了制備規(guī)模的酶促反應(yīng)，成功合成出如3ad、3ao等多種苯胺衍生物，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法的應(yīng)用潛力。
圖3.底物適用性拓展與部分放大試驗(yàn)
為了深入了解這一酶促反應(yīng)的機(jī)理，研究人員對(duì)生物催化脫氫偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行了一系列動(dòng)力學(xué)研究。首先，研究人員使用二級(jí)苯胺合成酶進(jìn)化譜系中的各個(gè)變體針對(duì)3aa的酶催化合成進(jìn)行了時(shí)間進(jìn)程實(shí)驗(yàn)，并通過(guò)Michaelis-Menten曲線分析酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明定向進(jìn)化引入的突變有效地提高了苯胺合成酶OYE_G3的kcat。隨后，研究人員用類似的方法對(duì)三級(jí)苯胺3ca的合成反應(yīng)進(jìn)行了時(shí)間進(jìn)程研究。與二級(jí)苯胺合成體系不同的是，三級(jí)苯胺合成反應(yīng)的前期會(huì)發(fā)生可逆的aza-Michael加成過(guò)程形成中間體6b，因此反應(yīng)會(huì)顯示出明顯的誘導(dǎo)期（induction period）。為了明確探究酶活性是否從環(huán)己酮脫氫轉(zhuǎn)移到亞胺脫氫，研究人員比較了最初變體（OYE_G0）與定向進(jìn)化譜系的兩個(gè)最終變體（OYE_G3和OYE_M3）生成苯酚的活性變化（圖4e和4f）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，進(jìn)化后的變體對(duì)于苯酚生成過(guò)程的催化能力顯著下降。
圖4.苯胺合成酶系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)研究
圖5.酶催化苯胺合成反應(yīng)的推測(cè)過(guò)程
基于黃素依賴酶的獨(dú)特脫氫催化機(jī)制，研究人員開發(fā)了非天然的苯胺合成酶系統(tǒng)，可以有效地制備二級(jí)與三級(jí)苯胺衍生物。這種酶催化系統(tǒng)可以通過(guò)后續(xù)的進(jìn)化進(jìn)一步提高催化效率，并通過(guò)計(jì)算與實(shí)驗(yàn)結(jié)合的方式完善機(jī)制研究。總體而言，這項(xiàng)工作為苯胺化合物的合成提供了高效、環(huán)境友好的生物合成策略，在生物催化和藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。
清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院研究員劉臻為論文的通訊作者，劉臻實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合培養(yǎng)博士生趙翔為論文的第一作者。研究得到科技部、清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院以及北京生命科學(xué)研究所的支持。
論文鏈接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202505252
供稿：生物醫(yī)學(xué)交叉研究院
編輯：李華山
審核：郭玲
