清華新聞網(wǎng)4月9日電 苯胺類化合物作為關(guān)鍵結(jié)構(gòu)單元,，普遍存在于藥物分子及其他活性物質(zhì)中,，同時是多種工業(yè)材料制備的核心中間體,。透明度市場研究（Transparency Market Research）發(fā)布的《2021-2031年全球苯胺衍生物市場預(yù)測報告》顯示,，到2031年,，全球苯胺類衍生物的市場價值將達(dá)到110億美元。因此,，開發(fā)芳胺骨架的高效合成方法在藥物開發(fā)和材料科學(xué)等領(lǐng)域至關(guān)重要,。傳統(tǒng)的苯胺類化合物的工業(yè)合成工藝主要以苯或其衍生物出發(fā)，通過苯環(huán)硝基化反應(yīng)以及隨后的硝基苯催化加氫獲得苯胺,。在醫(yī)藥中間體合成領(lǐng)域,，過渡金屬催化的C–N鍵偶聯(lián)反應(yīng)同樣被廣泛應(yīng)用，這類方法的發(fā)展對于藥物分子的構(gòu)建具有關(guān)鍵意義,。盡管這些經(jīng)典方法目前仍無可替代,，科研工作者持續(xù)致力于探索更加綠色溫和、可持續(xù)的合成體系,，從而最終避免使用高溫高壓的反應(yīng)條件,，或者高成本且具有生理毒性的過渡金屬催化劑。本研究聚焦生物酶催化體系的開發(fā),，通過定向進(jìn)化初步驗證了該策略合成苯胺類化合物的可行性,。值得注意的是,，相較于自然界中存在的基于P450體系的苯胺合成酶，這一生物催化體系展現(xiàn)出截然不同的催化機(jī)制,，為酶催化在苯胺合成領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的突破方向,。
4月7日，清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院劉臻課題組在《德國應(yīng)用化學(xué)》（Angewandte Chemie International Edition）發(fā)表了題為“氧化胺化合成苯胺的酶促平臺”（An Enzymatic Platform for Aniline Synthesis through Oxidative Amination）的研究論文,。通過改造該實驗室開發(fā)的黃素（FMN）依賴酶PtOYE（源自Parageobacillus thermantarcticus）,，這一催化體系可以有效地將胺類化合物和環(huán)己酮衍生物組合，通過氧化胺化的機(jī)制制備多種二級和三級苯胺,。針對結(jié)構(gòu)不同的胺類底物,，研究人員分別通過兩條定向進(jìn)化路徑獲得了各自的優(yōu)勢突變體OYE_G3和OYE_M3，提高了酶催化的效率并抑制了環(huán)己酮直接脫氫生成苯酚的副反應(yīng),。通過多組動力學(xué)實驗,，研究人員系統(tǒng)研究了這類苯胺合成酶的催化機(jī)制。實驗表明,，優(yōu)勢突變體不僅提高了亞胺中間體芳構(gòu)化的催化效率,，且降低了環(huán)己酮直接脫氫生成苯酚的活性，形成了有利于目標(biāo)反應(yīng)的協(xié)同效應(yīng),。
圖1.苯胺類化合物的生物合成新策略
研究初期,，研究人員首先對野生型黃素酶及其突變體的亞胺脫氫芳構(gòu)化活性進(jìn)行了系統(tǒng)性篩選。實驗數(shù)據(jù)顯示,，課題組現(xiàn)有酶庫中的OYE_G0突變體對于目標(biāo)反應(yīng)具有顯著的初始活性,，能夠以最高的轉(zhuǎn)化率（38%）催化生成目標(biāo)產(chǎn)物3aa且目標(biāo)產(chǎn)物與副產(chǎn)物4a的比例最優(yōu)，體現(xiàn)了這類脫氫酶具有被進(jìn)一步優(yōu)化的潛力,。
基于這一發(fā)現(xiàn),，研究人員隨后利用OYE_G0作為起始模版，分別針對二級苯胺和三級苯胺的合成過程進(jìn)行了多輪蛋白質(zhì)工程化改造與篩選,。通過多個活性位點(diǎn)的定點(diǎn)飽和突變以及隨機(jī)突變,，研究人員最終分別獲得催化合成二級苯胺的突變體OYE_G3以及催化合成三級苯胺的優(yōu)勢突變體OYE_M3。
圖2.針對二級與三級苯胺分別開展的蛋白質(zhì)工程化改造
在確定了最優(yōu)酶突變體和最適反應(yīng)條件之后,，研究人員系統(tǒng)地研究了這些苯胺合成酶的底物適用范圍,。結(jié)果表明，這種生物催化方法展示出了良好的底物兼容性和官能團(tuán)耐受性,，可以將不同取代的芐胺,、含雜環(huán)的伯胺以及部分烷基胺轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的二級苯胺；也可成功地將部分仲胺轉(zhuǎn)化為三級苯胺,。此外,，不同取代模式的環(huán)己酮也能參與反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上,，研究人員選取多個底物進(jìn)行了制備規(guī)模的酶促反應(yīng),，成功合成出如3ad,、3ao等多種苯胺衍生物,，進(jìn)一步驗證了該方法的應(yīng)用潛力,。
圖3.底物適用性拓展與部分放大試驗
為了深入了解這一酶促反應(yīng)的機(jī)理，研究人員對生物催化脫氫偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行了一系列動力學(xué)研究,。首先,，研究人員使用二級苯胺合成酶進(jìn)化譜系中的各個變體針對3aa的酶催化合成進(jìn)行了時間進(jìn)程實驗，并通過Michaelis-Menten曲線分析酶的動力學(xué)參數(shù),。實驗結(jié)果表明定向進(jìn)化引入的突變有效地提高了苯胺合成酶OYE_G3的kcat,。隨后，研究人員用類似的方法對三級苯胺3ca的合成反應(yīng)進(jìn)行了時間進(jìn)程研究,。與二級苯胺合成體系不同的是,，三級苯胺合成反應(yīng)的前期會發(fā)生可逆的aza-Michael加成過程形成中間體6b，因此反應(yīng)會顯示出明顯的誘導(dǎo)期（induction period）,。為了明確探究酶活性是否從環(huán)己酮脫氫轉(zhuǎn)移到亞胺脫氫,，研究人員比較了最初變體（OYE_G0）與定向進(jìn)化譜系的兩個最終變體（OYE_G3和OYE_M3）生成苯酚的活性變化（圖4e和4f）。實驗結(jié)果表明,，進(jìn)化后的變體對于苯酚生成過程的催化能力顯著下降,。
圖4.苯胺合成酶系統(tǒng)的動力學(xué)研究
圖5.酶催化苯胺合成反應(yīng)的推測過程
基于黃素依賴酶的獨(dú)特脫氫催化機(jī)制，研究人員開發(fā)了非天然的苯胺合成酶系統(tǒng),，可以有效地制備二級與三級苯胺衍生物,。這種酶催化系統(tǒng)可以通過后續(xù)的進(jìn)化進(jìn)一步提高催化效率，并通過計算與實驗結(jié)合的方式完善機(jī)制研究,?？傮w而言，這項工作為苯胺化合物的合成提供了高效,、環(huán)境友好的生物合成策略,，在生物催化和藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。
清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院研究員劉臻為論文的通訊作者,，劉臻實驗室聯(lián)合培養(yǎng)博士生趙翔為論文的第一作者,。研究得到科技部、清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院以及北京生命科學(xué)研究所的支持,。
論文鏈接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202505252
供稿：生物醫(yī)學(xué)交叉研究院
編輯：李華山
審核：郭玲
