清華譚旭研究組合作發(fā)文報道體內(nèi)靶向基因治療新方法

清華新聞網(wǎng)1月26日電 1月24日，清華大學譚旭研究組與美國俄亥俄州立大學董一洲研究組合作在《細胞研究》（Cell Research）上發(fā)表了題為《一種實現(xiàn)體內(nèi)基因剪切的非病毒性的CRISPR/Cas9輸送系統(tǒng)》(A non-viral CRISPR/Cas9 delivery system for therapeutic gene targeting in viv)，在國際上首先研發(fā)出一種新型CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,簡稱CRISPR，譯為“規(guī)律成簇間隔短回文重復體系”)遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠在體內(nèi)遞送CRISPR體系的Cas9蛋白（Cas即為CRISPR-associated, 與規(guī)律成簇間隔短回文重復體系相關的）和單鏈引導RNA（sgRNA）至肝臟，從而在單鏈引導RNA的引導下靶向切割外源或內(nèi)源致病基因從而達到治療肝病的目的。該種新型遞送系統(tǒng)為CRISPR這一強有力的基因編輯工具，在臨床上的實際應用開辟了新途徑。

納米脂質(zhì)顆粒能有效的把Cas9 mRNA和針對乙肝病毒DNA的引導RNA輸送到動物的肝細胞內(nèi)。Cas mRNA隨后被翻譯成 Cas9蛋白，蛋白與引導RNA結(jié)合后特異性的識別乙肝病毒DNA并對其進行剪切，導致病毒DNA突變或者降解，從而從源頭上降低病毒的水平。

自上世紀90年代以來，基因治療逐漸興起，其通過補償基因缺陷或修正異常致病基因從而達到治療的目的。CRISPR是在細菌中發(fā)現(xiàn)的一種DNA剪編輯系統(tǒng)，由于其高效特異的DNA剪切和編輯能力在科研領域已經(jīng)得到廣泛應用，而在臨床治療中其應用前景也非常值得期待。已有的CRISPR體內(nèi)輸送是通過運用腺病毒表達體系來表達Cas9和sgRNA，就像腺病毒在基因治療歷史中的巨大作用一樣，但也存在諸如腺病毒缺乏靶向性，本身免疫源性較高，病毒在體內(nèi)有一定重組突變機率等問題。而且，腺病毒在細胞內(nèi)的長期穩(wěn)定表達Cas9 蛋白，也有可能帶來長期的毒副作用。

基于脂質(zhì)納米顆粒的核酸輸送系統(tǒng)已經(jīng)在活體內(nèi)輸送小RNA，如siRNA上表現(xiàn)出良好的效果。譚旭課題組與董一洲研究組合作研發(fā)了一種新型脂質(zhì)納米顆粒系統(tǒng)，可以包裹Cas9蛋白的mRNA以及單鏈引導RNA，并在活體內(nèi)有效的輸送至肝臟并進行表達,對特定致病基因進行切割。

為測試所研發(fā)的新型脂質(zhì)納米顆粒系統(tǒng)的實際效果，研究組分別選取了以下一個外源性靶點和一個內(nèi)源性靶點進行測試。選擇的外源性靶點是乙肝病毒（HBV）基因組。全球乙肝病毒感染者約有3.5億人，而在中國，乙肝病毒攜帶也是一個嚴重的社會問題。乙肝病毒難以徹底清除的主要原因是其基因組以一種共價閉環(huán)DNA（covalently closed circular DNA或cccDNA)形式存在，而現(xiàn)有治療手段均無法觸及cccDNA；選擇的內(nèi)源性靶點是前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9）是當前針對高膽固醇血癥和其它心血管疾病藥物研發(fā)的重要靶點。就目前來看，針對PCSK9的藥物主要是抗體類藥物，需要長期多次服用，價格昂貴。上述二者均有希望通過編輯其基因序列而達到治療的目的，故研究組選取此二者為對象，測試這種新型的藥物遞送系統(tǒng)。

研究發(fā)現(xiàn)在細胞水平上，經(jīng)這種新型脂質(zhì)納米顆粒（LNP）包裹的Cas9/sgRNA，能夠有效的對細胞中HBV cccDNA和Pcsk9基因進行切割，并有效的降低HBV相關抗原的表達。動物實驗結(jié)果表明，這種新型脂質(zhì)納米顆粒可以有效遞送Cas9/sgRNA輸送至肝臟進行表達，并且尾靜脈注射6小時后Cas9蛋白表達量達到最大，其后逐步降低，24小時后消失。在肝臟內(nèi)，所遞送的Cas9/sgRNA能對內(nèi)外源基因序列進行有效的特異性剪切，進而降低相關蛋白的表達量。一次注射能有效降低乙肝病毒表達量50％以上。國際審稿人認為這項工作是本領域激動人心的成果，對CRISPR/Cas9系統(tǒng)未來的臨床轉(zhuǎn)化研究有重要意義。

論文通訊作者為譚旭和董一洲。清華大學生命科學學院博士生蔣超、梅淼，俄亥俄州大學博士后李斌、清華大學醫(yī)學院博士生朱修銳為共同第一作者。清華大學生物醫(yī)學工程系的郭永課題組也有重要貢獻。該工作得到了科技部重點研發(fā)計劃，生命科學聯(lián)合中心和美國蓋茨基金會的資助。

文章鏈接：

http://www.nature.com/cr/journal/vaop/ncurrent/full/cr201716a.html

供稿：藥學院 編輯：華山 襄樺