清華深圳國際研究生院彌勝利、孫偉課題組在角膜基質(zhì)誘導(dǎo)再生領(lǐng)域取得重要進(jìn)展

清華新聞網(wǎng)3月27日電  近期,，清華大學(xué)深圳國際研究生院彌勝利和孫偉課題組在角膜基質(zhì)誘導(dǎo)再生領(lǐng)域取得重要進(jìn)展,，相關(guān)成果于2020年3月18日發(fā)表在《自然·通訊》（Nature Communications）期刊上，題為“纖維增強(qiáng)的GelMA水凝膠用于誘導(dǎo)角膜基質(zhì)的再生（Fiber reinforced GelMA hydrogel to induce the regeneration of corneal stroma）”,。

眼角膜作為視覺成像系統(tǒng)中一個至關(guān)重要的組織,，是眼睛最前面的凸形高度透明物質(zhì)，可以保護(hù)眼內(nèi)的微結(jié)構(gòu)及組織,，并為眼睛提供大部分屈光力,。但是角膜損傷、感染及一些先天性因素導(dǎo)致角膜疾病成為全球第二大致盲疾病,。同種異體角膜,、人工角膜及人的羊膜移植是三類臨床上應(yīng)用最廣泛的角膜疾病治療方法，但是這些方法都會存在一定的問題或缺陷,。因此,，利用先進(jìn)的生物制造工程的方法（Biofabrication）開發(fā)出一種治療性的角膜支架，用于替代受疾病影響的角膜組織或誘導(dǎo)角膜組織自身再生,，是至關(guān)重要的,。目前，角膜組織誘導(dǎo)再生的難點(diǎn)在于角膜基質(zhì)層,，該層組織是角膜的主要組成部分,，具有多層正交定向的納米纖維板層組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，利用傳統(tǒng)的生物工程的方法很難真實(shí)地模擬基質(zhì)層的結(jié)構(gòu),。纖維板層之間分布著角膜基質(zhì)細(xì)胞,，這種細(xì)胞在體外培養(yǎng)及角膜組織損傷時很容易轉(zhuǎn)化為角膜成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致角膜出現(xiàn)瘢痕,。因此,，制備能夠模擬天然角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)的支架,，同時保持角膜基質(zhì)細(xì)胞的表型，誘導(dǎo)角膜基質(zhì)的再生,，是一個重大的挑戰(zhàn),。

針對這一難題，彌勝利和孫偉課題組提出了使用近場靜電紡絲技術(shù)制備網(wǎng)格狀的亞微米纖維支架,，并和水凝膠技術(shù)結(jié)合,，制備了纖維水凝膠復(fù)合支架，用于模擬正交定向的角膜基質(zhì)板層結(jié)構(gòu)和板層之間起連接作用的糖蛋白,。課題組提出了一種最優(yōu)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及化學(xué)因子的組合,，可以抑制角膜基質(zhì)細(xì)胞的成纖維分化，保持其表型,，并最終實(shí)現(xiàn)角膜基質(zhì)的誘導(dǎo)再生,。 

圖1：（a）近場靜電紡絲技術(shù)制備的具有不同纖維間距的PECL網(wǎng)格狀亞微米纖維支架在不同放大倍數(shù)下的SEM圖片；（b）接種在100um網(wǎng)格狀纖維支架上的角膜緣基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞骨架及細(xì)胞核染色,，細(xì)胞可以在支架上沿著纖維方向生長,；（c）5% GelMA水凝膠內(nèi)封裝的角膜緣基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行活死染色圖片；（d）5% GelMA水凝膠內(nèi)封裝的角膜緣基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞骨架及細(xì)胞核染色圖片,；（e）纖維水凝膠復(fù)合支架的SEM圖片,。

目前近場靜電紡絲技術(shù)應(yīng)用最廣泛的材料是PCL，但是由于PCL是疏水材料,，不利于細(xì)胞的粘附,，因此該研究利用PEG作為引發(fā)劑，合成了PEG和PCL的共聚物PECL,，顯著提高了PCL的親水性,。課題組首次利用近場靜電紡絲技術(shù)成功制備了正交定向的PECL亞微米纖維支架 (圖1a)，角膜緣基質(zhì)干細(xì)胞可以在支架表面黏附并沿著纖維方向鋪展及生長 (圖1b),。

研究通過將MA修飾到明膠大分子鏈上合成了GelMA,，探究出最優(yōu)的MA修飾度及GelMA濃度，可以使封裝在GelMA水凝膠內(nèi)的角膜緣基質(zhì)干細(xì)胞保持高的細(xì)胞活性(圖1c)并能鋪展開(圖1d),。

課題組采用模具灌注的方式制備了纖維水凝膠復(fù)合支架 (圖1e),，通過研究不同纖維間距的網(wǎng)格狀支架對纖維水凝膠復(fù)合支架理化性能的影響，找出了最優(yōu)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可以使纖維水凝膠在力學(xué)性能,、透光度和溶脹性方面最接近于天然的角膜組織,。研究將角膜緣基質(zhì)干細(xì)胞接種在2D的細(xì)胞培養(yǎng)皿、3D的GelMA水凝膠及最優(yōu)的纖維水凝膠復(fù)合支架內(nèi),，并研究角膜緣基質(zhì)干細(xì)胞在含血清及不含血清的培養(yǎng)基中的分化及角膜基質(zhì)細(xì)胞表型的維持,。研究表明,，這種最優(yōu)的纖維水凝膠的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及無血清培養(yǎng)基可以抑制角膜基質(zhì)細(xì)胞向成纖維細(xì)胞分化,。

圖2 大鼠角膜基質(zhì)內(nèi)板層移植實(shí)驗(yàn)及評估：（a）5種支架移植后裂隙燈觀察圖片,；（b）支架移植后OCT觀察圖片，標(biāo)尺是1000um,；（c）術(shù)后不同時間段中央角膜的厚度,；（d）術(shù)后1個月和3個月免疫熒光染色圖片觀察組織誘導(dǎo)再生情況，標(biāo)尺是100um,；（e）術(shù)后1個月和3個月HE染色圖片觀察組織誘導(dǎo)再生情況,，標(biāo)尺是100um。

最后,，研究使用大鼠進(jìn)行角膜內(nèi)的板層移植實(shí)驗(yàn),，分別進(jìn)行了3D GelMA水凝膠、含化學(xué)因子3D GelMA,、最優(yōu)纖維水凝膠支架及含化學(xué)因子最優(yōu)纖維水凝膠支架的移植,，對照組為自體角膜移植（圖2a）。術(shù)后通過OCT,、免疫熒光染色及HE染色進(jìn)行3個月的研究觀察（圖2b-e）發(fā)現(xiàn)相比于其他的支架,，含化學(xué)因子的最優(yōu)纖維水凝膠支架的移植可以最好地實(shí)現(xiàn)角膜基質(zhì)的誘導(dǎo)再生。

本論文第一作者為清華-伯克利深圳學(xué)院博士生孔彬和清華大學(xué)深圳國際研究生院碩士生陳赟及劉睿,，論文通訊作者為彌勝利副研究員和孫偉教授,。該研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計劃的支持。

論文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-020-14887-9

供稿：深圳國際研究生院

編輯：李華山

審核：程曦