清華新聞網(wǎng)9月9日電 新冠病毒自2019年12月以來蔓延至全球各地，特別是近期受到廣泛關(guān)注的德爾塔變種,，平均能夠傳染8-9個人,，傳播能力大幅度提高。新冠病毒的變種為什么能夠具有這么強的傳染能力呢,？為了解釋這一原因,，清華大學藥學院譚旭實驗室和中國科學技術(shù)大學生命科學學院金騰川實驗室從細胞免疫的角度出發(fā)，通過高通量篩選的方法鑒定了新冠病毒特異性CD8+ T 細胞的抗原識別表位,，并找到了新冠病毒變種逃逸細胞免疫的證據(jù),，為后續(xù)疫苗的設計和優(yōu)化提供了新的思路。
近日,，研究團隊在國際一流期刊《細胞報道》（Cell Reports）上發(fā)表了題為“鑒定新冠康復者的細胞免疫表位發(fā)現(xiàn)新冠病毒變種的細胞免疫減弱的現(xiàn)象”（Profiling CD8+ T Cell Epitopes of COVID-19 Convalescents Reveals Reduced Cellular Immune Responses to SARS-CoV-2 Variants）的研究論文,。
圖1：新冠病毒特異性CD8+ T細胞抗原表位的鑒定
新冠病毒德爾塔變種的命名來自于美國疾病控制中心和世界衛(wèi)生組織的分類系統(tǒng)，由于新冠病毒在傳播過程中在不斷地變異,，為了更好地定義新冠病毒的變種,，美國疾病控制中心和世界衛(wèi)生組織獨立建立了一個分類系統(tǒng)，將新冠病毒的變異體分為關(guān)注變種(Variants of concern)和待關(guān)注變種(Variants of interest),。關(guān)注變種的特點是：具有更高的傳染性,，即可以感染更多的人群；誘發(fā)更嚴重的疾病 (即住院或死亡人數(shù)增加),；降低治療和疫苗的有效性,；可能逃避診斷檢測。
關(guān)注變種一共包括四種變異體：阿爾法變種 (B.1.1.7),，貝塔變種 (B.1.351),，伽馬變種 (P.1)，德爾塔變種 (B.1.617.2) ,；待關(guān)注變種被認為是危險性較低的關(guān)注變種，世衛(wèi)組織于2021年6月22日更新了待關(guān)注變種的名單,，包括7個變異體：Epsilon (B.1.427和B.1.429),，Zeta (P.2)， Eta(B.1.525),，Xita (P.3),，Iota (B.1.526)，Kappa (B.1.617.1)和最近廣受關(guān)注的拉姆達(C.37),。
全球流感共享數(shù)據(jù)庫(GISAID)總結(jié)了2021年所有在官網(wǎng)提交的新冠病毒序列的比例匯總(圖2),，可以看到新冠病毒變種在全球感染范圍的動態(tài)變化。
圖2:全球流感共享數(shù)據(jù)庫（GISAID）官網(wǎng)收錄的新冠病毒序列比例統(tǒng)計
從圖2可以看到，2021年1月起,，阿爾法變種首先占據(jù)傳播優(yōu)勢,。然而從5月開始，德爾塔變種逐漸代替阿爾法變種,，成為在全球傳播的絕對優(yōu)勢變種,。德爾塔變種是在2020年10月首次在印度馬哈拉施特拉邦被發(fā)現(xiàn)的。隨后在2020年末僅用2個月的時間傳播到整個印度,，并超越了在印度傳播的原有的73個譜系,，可見傳播能力之強。至今德爾塔變種已經(jīng)傳播到了200多個國家,，是目前最值得關(guān)注的變種,。
新冠病毒變種的優(yōu)勢建立和病毒的感染能力、免疫逃逸能力,、傳播能力等方面都有關(guān)系,。以德爾塔變種為例，已有研究報道,，與阿爾法變種相比,，德爾塔變種的S蛋白能夠更加高效地被宿主細胞蛋白酶切割形成具有功能的蛋白，在類器官水平上極大提高了德爾塔變種入侵細胞的效率,，也加快了德爾塔變種在感染初期的復制速度,，為德爾塔變種優(yōu)勢建立提供了思路。除了感染能力的提高,，關(guān)注變種也增強了免疫逃逸能力,，以德爾塔變種為例，和野生型新冠病毒相比,，新冠病毒康復者血清中和抗體對德爾塔變種的中和能力平均下降6倍,；疫苗(ChAdOx-1和BNT162b2)對德爾塔變種的防護效果平均下降8倍；臨床批準的用于治療新冠病毒相關(guān)疾病的單克隆抗體bamlavinimab和imdevimab對德爾塔變種的中和能力分別下降1000倍和50倍,。
雖然關(guān)注變種對抗體介導的體液免疫敏感度下降,，但由于關(guān)注變種在傳播過程中絕大部分人都是初次感染，體內(nèi)并沒有中和抗體,，因此對已知抗體的反應較弱能夠提示我們現(xiàn)有疫苗對于這些變種的保護性會有所下降,，但不能完全解釋關(guān)注變種的大規(guī)模傳播。此外根據(jù)實驗數(shù)據(jù),，德爾塔變種對康復血清或疫苗后血清的中和抗體敏感性下降程度和貝塔變種(B.1.315)接近,，但傳播程度卻遠超貝塔變種，這提示除了體液免疫之外,，CD8+ T細胞介導的細胞免疫應答的逃逸也可能促進了新冠病毒優(yōu)勢變種的不斷傳播,。先前的研究已經(jīng)表明,，細胞免疫應答不僅與新冠病情的輕重發(fā)展具有相關(guān)性，特別地,，新冠病毒特異性CD8+ T細胞早于中和抗體被檢測到,，說明細胞免疫應答在病毒感染早期就開始發(fā)揮作用，而這種早期的免疫抑制對于機體防御新冠病毒,、抑制新冠病毒的傳播可能是非常重要的,。此外，對2003年SARS康復患者的長期研究表明,，細胞免疫保持的時間長度很長,，有的甚至能長達17年，相對而言,，康復患者的抗體免疫記憶則要短很多,。系統(tǒng)地了解新冠病毒感染者特別是康復患者的細胞免疫應答，對于我們了解病人的病情發(fā)展的免疫決定因素,，幫助新型疫苗設計甚至預測病人對疫苗的反應,，都有重要意義。
探究細胞免疫應答的重要步驟就是鑒定新冠病毒特異性CD8+ T細胞的抗原識別表位,。清華大學譚旭課題組運用T-Scan技術(shù),，研究了能夠引起人體CD8 T細胞響應的新冠病毒抗原表位的分布，并發(fā)現(xiàn)了新冠基因組上的4個氨基酸位點的突變可能賦予關(guān)注變種逃逸細胞免疫的能力從而促進病毒的傳播,，為關(guān)注變種的防范提供了細胞免疫方向的基礎 (圖1),。
T-Scan技術(shù)是2019年由美國哈佛大學醫(yī)學院斯蒂芬·埃利奇（Stephen Elledge）教授發(fā)明的用于識別T細胞抗原的高通量篩選平臺。運用T-Scan技術(shù)構(gòu)建新冠病毒抗原呈遞的靶細胞文庫的原理（如圖1所示）,。首先運用DNA芯片大規(guī)模合成技術(shù),，合成覆蓋新冠病毒編碼的所有蛋白的多肽基因序列，每個多肽56氨基酸,，一共有9179條序列,。之后使用慢病毒載體將新冠病毒多肽抗原的基因文庫轉(zhuǎn)達到靶細胞中，在靶細胞內(nèi)進行多肽抗原基因的表達和多肽抗原的內(nèi)源性加工最終由靶細胞的主要組織相容性復合體(MHC)分子將新冠病毒抗原呈遞到細胞表面,，較好地模擬了細胞被病毒感染后將病毒抗原呈遞到細胞表面的過程,。此外，靶細胞還攜帶響應顆粒酶B（Granzyme B, GzB）活性的IFP熒光報告基因(圖3),，用于篩選被CD8+ T細胞識別的靶細胞,。GzB是一種絲氨酸蛋白酶，平時儲存在CD8+ T細胞內(nèi)的細胞毒性顆粒中,，當CD8+ T細胞識別靶細胞呈遞的病毒抗原后被活化，CD8+ T開始執(zhí)行殺傷功能,，通過穿孔素在細胞膜上形成孔洞將裝載GzB的細胞毒性顆粒特異性分泌到靶細胞中,。GzB進入靶細胞后激活IFP熒光報告基因,。接下來可以通過流式篩選富集被識別的靶細胞，并通過下一代測序鑒定靶細胞呈遞的抗原序列,。
圖3: 響應Granzyme B (GzB) 的熒光報告系統(tǒng)
CD8+ T細胞的識別具有MHC-I類分子限制性,，只能識別和自身MHC基因型匹配的MHC分子所呈遞的抗原。MHC-I類分子包括A,B,C三種基因型,，稱為HLA-A,、HLA-B和HLA-C，每一種基因型又包括了多種等位基因,，因此MHC分子的多樣性非常豐富,。作者選取了中國人群中頻率最高的四種HLA-A基因型進行研究，包括HLA-A*02:01,、HLA-A*02:07,、HLA-A*11:01和HLA-A*24:02（分別以占中國人口的10.9%、9.2% ,、21.4%和14.4%）,。
作者構(gòu)建了過表達HLA-A*02:01、HLA-A*02:07,、HLA-A*11:01或HLA-A*24:02的靶細胞文庫來呈遞新冠病毒的抗原表位,。在檢測了新冠病毒康復者的HLA-A基因型之后，將基因型匹配的靶細胞文庫和新冠病毒康復者的CD8 + T細胞進行孵育,，從涵蓋了上述四個HLA基因型的10個新冠病毒康復者的PBMC中分離了記憶性CD8+ T細胞進行T-Scan篩選,，共篩選到70條潛在的新冠病毒特異性CD8+ T細胞抗原識別表位，顯著富集了新冠病毒ORF1a,、ORF1b和S蛋白的多肽片段,，說明這三個基因可能是CD8+ T細胞介導的細胞免疫的重要抗原來源。
圖4: 保守性CD8+ T細胞抗原表位
作者首先報道了新冠病毒和其他冠狀病毒（包括SARS,，和其他4種常見的引起普通感冒的冠狀病毒）在氨基酸序列上高度保守的抗原表位（圖4）,，并通過細胞內(nèi)INF-y染色的實驗驗證了其中7條多肽能夠在健康人中誘導CD8 + T細胞的免疫應答，這也驗證了先前對未感染新冠人群的預存的細胞免疫記憶的研究,，表明人體內(nèi)如果有針對其它冠狀病毒的細胞免疫應答,，也會針對新冠病毒有一定的交叉免疫反應，而這種預存的細胞免疫的水平高低也可能部分決定了人群的病情差異,。
新冠病毒的S蛋白介導病毒進入細胞,，是中和抗體的主要識別靶點，S蛋白上的突變被證實能夠?qū)е虏《咎右葜泻涂贵w,，也因此最為受到關(guān)注,。圖5列出了4種關(guān)注變種的起源以及其在新冠病毒S蛋白上的突變位點。
圖5: 新冠病毒的4種全球關(guān)注變種（關(guān)注變種）及其所攜帶的氨基酸突變位點(來自網(wǎng)站https://covariants.org )
為了探究關(guān)注變種的點突變是否幫助病毒逃逸CD8+ T細胞的免疫識別,，作者重點關(guān)注了覆蓋關(guān)注變種突變位點的4條抗原表位: GVY,、KIA,、NYN、IIW,；這四條抗原表位分別包括了S蛋白上的Y144-缺失突變,、K417N/T突變、L452R突變和ORF1a蛋白上的I2230T突變,。通過胞內(nèi)IFN-γ檢測和MHC-四聚體染色的方法,，作者驗證了這四條抗原表位能夠有效引起新冠康復患者或疫苗免疫后志愿者的CD8+ T細胞免疫應答。為了進一步探究關(guān)注變種攜帶的突變對CD8+ T細胞免疫的影響,，作者合成了攜帶突變位點的抗原多肽,，并比較了野生型抗原多肽和突變多肽的抗原有效性。對比發(fā)現(xiàn),，和野生型多肽相比,，新冠康復患者/疫苗免疫后志愿者的CD8+ T細胞對攜帶突變位點的抗原多肽的響應能力下降（圖6）。這說明了這些位點的氨基酸對抗原識別及細胞免疫的產(chǎn)生非常重要,，而關(guān)注變種將這些關(guān)鍵氨基酸突變之后,，可能會降低病毒對細胞免疫的刺激，從而實現(xiàn)細胞免疫的逃逸,。
圖6：抗原表位的突變降低了對疫苗接種者及新冠康復者體內(nèi)CD8+ T細胞激活的效率
更近一步,，金騰川課題組通過晶體學的方法，解析了其中2條抗原表位和對應MHC分子的復合物晶體結(jié)構(gòu)（圖7）,?？梢郧逦乜吹皆贙IA-HLA-A*02:01復合物（圖7A）中，417位的賴氨酸的正電荷側(cè)鏈與HLA-A*02:01蛋白的W167通過Pi陽離子相互作用牢牢結(jié)合,，貝塔變種和伽馬變種攜帶的K417N/T突變將打破這一相互作用,，導致HLA-A*02:01蛋白無法識別這一抗原表位，作者也通過生化的方法證明了這一結(jié)論,。在NYN-HLA-A*24:02復合物（圖7B）中,，452位的亮氨酸的疏水側(cè)鏈埋在了HLA-A*24:02蛋白表面的疏水口袋中，通過疏水相互作用緊密結(jié)合,，關(guān)鍵位點452位氨基酸的突變可能幫助病毒逃逸抗原表位NYN介導的細胞免疫,。
圖7: KIA&HLA-A*02:01復合物 (A) 和NYN&HLA-A*24:02復合物 (B) 的晶體結(jié)構(gòu)
以德爾塔變種為例，德爾塔變種攜帶的L452R的突變將引入帶正電荷的精氨酸R,，完全破壞了原有的疏水相互作用,，進而破壞NYN抗原表位的呈遞。2021年7月Motozono等人在《細胞·宿主和微生物》（Cell Host & Microbe）上報道了L452R介導新冠病毒的細胞免疫逃逸,，這篇研究也為此進一步提供了結(jié)構(gòu)學基礎,。
新冠病毒關(guān)注變種對免疫系統(tǒng)的逃逸大大增加了全球疫苗接種計劃的復雜度，了解關(guān)注變種免疫逃逸機制對未來疫苗的設計具有重要意義。先前的研究證實了HIV的進化動力之一就是通過突變CD8+ T細胞識別的抗原表位來達到逃逸細胞免疫的目的,。這篇文章中,，作者通過T-Scan技術(shù)篩選并鑒定了4條新冠病毒特異性CD8+ T細胞識別的關(guān)鍵性抗原表位，而新冠病毒關(guān)注變種（阿爾法,、貝塔、伽馬和德爾塔）至少突變了其中一條關(guān)鍵性抗原表位,，揭示了逃逸人體細胞免疫是新冠流行變種的普遍特點,。除此之外，作者篩選到的冠狀病毒保守性抗原表位,，也為后續(xù)的冠狀病毒的通用疫苗設計提供了理論基礎,。
清華大學藥學院博士生張航和中國科學技術(shù)大學生命科學與醫(yī)學部博士生鄧莎莎為本文共同第一作者，譚旭教授和金騰川教授為本文共同通訊作者,。該研究受到了國家自然科學基金委,，清華大學春風基金以及中科院先導項目的資助。清華大學董晨實驗室,、林欣實驗室和石彥實驗室為本項目提供了大力幫助,。
論文鏈接：
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(21)01155-4
供稿：藥學院
編輯：李華山
審核：呂婷
