生命如同一部波瀾壯闊的舞臺劇，遺傳基因是劇本，將劇本進行生動演繹的表演設(shè)計師則是表觀遺傳。在真核生物的細胞核內(nèi)，染色質(zhì)的化學(xué)修飾，及其凝聚與松弛狀態(tài)的形成、維持與切換，影響著遺傳信息的表達。這種機制被稱為表觀遺傳調(diào)控，是生物表型復(fù)雜性和多樣性的關(guān)鍵保證。組蛋白去乙酰化酶Rpd3是一類全局基因調(diào)控和共抑制因子，人源Rpd3S復(fù)合物的功能異常與腫瘤、心血管疾病發(fā)生相關(guān)，是健康維護及藥物開發(fā)的重要靶點。
基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院李海濤教授團隊和生命學(xué)院閆創(chuàng)業(yè)副教授團隊合作在Rpd3S介導(dǎo)的染色質(zhì)去乙酰化動態(tài)調(diào)控機制上取得重要突破，相關(guān)成果以“組蛋白H3第36位賴氨酸三甲基化（H3K36me3）指引下的多模式Rpd3S核小體去乙酰化”為題在《自然》（Nature）期刊作為研究長文發(fā)表，系統(tǒng)全面地對Rpd3S的結(jié)構(gòu)、底物識別催化，以及修飾調(diào)控等過程進行了分子機制解析，揭示出甲基化指引的染色質(zhì)去乙酰化動態(tài)和多模態(tài)模型，為疾病預(yù)防、藥物研發(fā)、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域帶來了新曙光。李海濤和閆創(chuàng)業(yè)為文章的共同通訊作者，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院博士后管海鵬和2017級博士生王沛為并列第一作者，2020級博士生張沛參與了主要研究。本成果入選2023年清華大學(xué)最受師生關(guān)注的年度亮點成果。
為使生命這部編排精密的舞臺劇順利演繹，不同功能的組蛋白在相關(guān)酶的作用下發(fā)生甲基化、乙酰化等多種翻譯后修飾，如同性格各異的演員穿著各色衣帽、使用各式道具上演環(huán)環(huán)相扣的多彩劇情。
1996年，Rpd3首次被報道作為組蛋白去乙酰化酶（HDAC）發(fā)揮作用，這一發(fā)現(xiàn)與同年組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）GCN5的轉(zhuǎn)錄共激活功能發(fā)現(xiàn)一起，標志著現(xiàn)代表觀遺傳學(xué)的興起。但在其后的20年間，Rpd3的分子結(jié)構(gòu)及其調(diào)控機制一直沒能得到深度解析，成為表觀遺傳領(lǐng)域的關(guān)鍵謎題之一。
隨著冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展和化學(xué)生物學(xué)的興起，科研人員對揭開這一表觀遺傳調(diào)控機制之謎的愿望愈發(fā)強烈。2017年，李海濤帶領(lǐng)課題組開始布局此項研究。
研究人員合影（從左至右：王沛、李海濤、閆創(chuàng)業(yè)、管海鵬、張沛）
從最初的實驗樣本獲取開始，難題與挑戰(zhàn)就紛至沓來。在酵母中，Rpd3與多種亞基Sin3、Ume1、Rco1、Eaf3組裝形成Rpd3S復(fù)合物。相比其他復(fù)合物，去乙酰化酶的催化模式更有動態(tài)性。“對我們來說，蛋白質(zhì)的柔性太大。”李海濤說，如同運轉(zhuǎn)中的風(fēng)扇，無法辨認出有多少只葉片在轉(zhuǎn)動，必須將風(fēng)扇暫停，才能看清其葉片構(gòu)造。而讓蛋白質(zhì)“暫停”的方法，則有賴于生化純化與冷凍制樣技術(shù)。
想要通過電鏡捕捉到穩(wěn)定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，首先要在冷凍制樣過程中將蛋白質(zhì)均勻分散。去垢劑是應(yīng)用較為廣泛的優(yōu)化蛋白質(zhì)可溶性表達的條件，“我們試了很多種去垢劑，又試了聚乙二醇等，都失敗了。” 管海鵬回憶道，“后來在李老師的指導(dǎo)下，嘗試用甘油這類具有雙極性的小分子。”甘油的濃度高于5%時，會影響成像襯度，使電鏡圖像的明暗差異降低，不利于識別。于是，團隊在0%-5%的甘油濃度范圍內(nèi)展開梯度篩選實驗，發(fā)現(xiàn)濃度在2.5%以上適宜優(yōu)化樣品。
從嘗試去垢劑到甘油濃度實驗，經(jīng)過近一年的篩選，團隊最終確定甘油濃度為3%時，釀酒酵母Rpd3S復(fù)合物在冷凍制樣過程中呈現(xiàn)穩(wěn)定的均勻分散狀態(tài)，“這是我們課題組能解析出Rpd3S復(fù)合物分子結(jié)構(gòu)的重要原因。”管海鵬說。
實驗操作
研究者用化學(xué)生物學(xué)手段合成出性質(zhì)均一的修飾組蛋白，并成功組裝出多種修飾組合類型的“人工設(shè)計”核小體，隨后開展了Rpd3S與修飾核小體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析攻關(guān)。然而柔性的干擾仍然存在，對此，閆創(chuàng)業(yè)團隊在處理柔性結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)方面經(jīng)驗豐富。于是，兩個團隊通力合作，放棄了過年的休息時間聯(lián)手攻關(guān)。
終于，2020年正月初九，正在實驗室里的管海鵬和王沛拿到突破性數(shù)據(jù)，意味著Rpd3S在被發(fā)現(xiàn)20多年后即將向人們展露其分子結(jié)構(gòu)！彼時，整個研究團隊在實驗室和微信群中欣喜若狂，共同慶祝突破性數(shù)據(jù)的到來。
Rpd3S復(fù)合物整體結(jié)構(gòu)以及亞基間相互作用與調(diào)控
Rpd3S復(fù)合物與核小體的結(jié)合
綜合單顆粒冷凍電鏡與化學(xué)生物學(xué)等跨學(xué)科技術(shù)，李海濤課題組解析出了釀酒酵母Rpd3S復(fù)合物在自由狀態(tài)和結(jié)合H3K36me3核小體狀態(tài)下的分子結(jié)構(gòu)模型。“這足以發(fā)一篇重磅論文，但我們不滿足止步于此。”李海濤說，“我們要進一步探究其修飾的調(diào)控機制，將捕捉到的Rpd3S結(jié)構(gòu)‘快照’置于生理的生命動態(tài)調(diào)控過程中，才是有意義的。”隨后攻關(guān)團隊布局開展了生化酶活和酵母遺傳學(xué)等功能實驗。
去乙酰化可以維持基因的正常轉(zhuǎn)錄延伸并防止異常轉(zhuǎn)錄發(fā)生。Rpd3S會對甲基化核小體中的組蛋白H3、H4進行識別，然后去除組蛋白上乙酰化位點。在系統(tǒng)化探究這一調(diào)控模式時，研究者發(fā)現(xiàn)H3有5個乙酰化位點，H4有4個乙酰化位點，而甲基化的位點更多，需要通過大量生化實驗不斷驗證每個位點酶活水平的變化。
“我們分段合成了不同的多肽底物，再利用化學(xué)鏈接的方式構(gòu)建出帶有不同修飾狀態(tài)的組蛋白。”王沛介紹道。合成多肽應(yīng)用了化學(xué)系教授劉磊的蛋白質(zhì)精準合成技術(shù)，其制備的樣本十分昂貴，合成操作需要研究者膽大心細。“雖然樣本昂貴且量小，但操作時我們并不會緊張，因為李老師一直讓我們放手去做，給我們創(chuàng)造了輕松的科研環(huán)境。”王沛笑著說，“他對我們的每一步小進展都給予鼓勵，是我們的‘夸夸群群主’。”
在結(jié)構(gòu)探究過程中，課題組意外發(fā)現(xiàn)Rpd3S具有獨特的非對稱架構(gòu)。在Rpd3S中，Eaf3、Rco1、Rpd3、Sin3結(jié)合形成催化核心復(fù)合物，而其中的兩組Eaf3-Rco1異源二聚體呈現(xiàn)出不對稱組裝方式，如同各司其職的左手與右手，會運用不同“道具”進行協(xié)同催化調(diào)控。
Rpd3S復(fù)合物在以修飾核小體為底物時的去乙酰化酶活
左手一側(cè)，Eaf3、Sin3、Rco1的組合通過對兩個H3K36me3標記、核小體DNA和連接DNA的多價識別，將Rpd3的催化中心定位在H4 N末端尾部附近，進行去乙酰化。
另一種調(diào)控模式位于右手一側(cè)。Eaf3和Rco1對未甲基化的H3第四位賴氨酸（H3K4un）和H3K36me3進行組合讀取，引導(dǎo)H3去乙酰化。但在該過程中，H3乙酰化的第9位賴氨酸（H3K9ac）修飾被特異性保留，課題組繼而對這一特殊情況展開系統(tǒng)研究。研究者通過突變實驗影響H3K9ac乙酰化的建立，發(fā)現(xiàn)缺失H3K9ac修飾幾乎影響著H3和H4所有其他位點乙酰化水平的建立。課題組據(jù)此提出，H3K9ac修飾和H3K36me3修飾可以作為“種子”，被乙酰化轉(zhuǎn)移酶NuA3、NuA4識別和快速H3、H4乙酰化修飾重新建立。
Rpd3S-NuA3/NuA4在轉(zhuǎn)錄過程中動態(tài)調(diào)控染色質(zhì)乙酰化水平模型
在對Rpd3S“左右手”的探究中，由于復(fù)合物具有動態(tài)性，研究者只能看到其左手一側(cè)，對于右手一側(cè)的解析則使用了系統(tǒng)的遺傳學(xué)及生物化學(xué)手段，從而全景式呈現(xiàn)了Rpd3S的結(jié)構(gòu)與催化機制。
然而體外的酶活實驗并不能代表復(fù)合物在體內(nèi)的調(diào)控模式，課題組又進一步探究了野生型Rpd3S和突變株在酵母表型上的影響，其結(jié)果與體外的酶活實驗結(jié)果吻合，完成了體內(nèi)體外的雙重驗證，從而完善了轉(zhuǎn)錄延伸過程中染色質(zhì)乙酰化修飾的動態(tài)調(diào)控模型。
Rpd3S復(fù)合物體內(nèi)功能研究和催化模型
如今，醫(yī)學(xué)正從以疾病為中心的傳統(tǒng)模式邁向以主動健康為中心的康建醫(yī)學(xué)（wellness medicine）新范式，在這一變革中，精準與數(shù)智醫(yī)學(xué)日益成為關(guān)鍵的新生力量。基因序列本身不能完全決定生物體的宿命，表觀遺傳學(xué)信息的建立與解讀更直接地表征了個體健康與疾病的狀態(tài)。因此在生命的舞臺劇中，只了解基因劇本是遠遠不夠的，更需要掌握各位演員的表演機制，從而更精準地調(diào)控各幕劇情，讓生命之姿活力綻放。
（注：胡思凡對本文亦有貢獻）
